Пространственно компактное расположение срезов личинок данио-рерио для пространственного транскриптомного анализа

Резюме

В данной работе мы представляем метод выравнивания и криоссекции нескольких образцов личинок рыбок данио-рерио (Danio rerio) и сбора их на одном предметном стекле для пространственного транскриптомного анализа.

Аннотация

Пространственные транскриптомные методы являются сложным инструментом в биомедицинских исследованиях для визуализации пространственно зарегистрированных паттернов экспрессии генов. Визуализация и анализ нескольких образцов с помощью платформ пространственной визуализации могут быть дорогостоящими. Проведение этих испытаний в нескольких экспериментальных условиях, как видно из исследований развития, еще больше увеличивает затраты. Чтобы снизить затраты, это исследование было направлено на оптимизацию методов и стратегий пространственного расположения транскриптомных образцов для исследований развития. В исследовании использовались рыбки данио-рерио, которые представляют собой хорошо зарекомендовавшую себя модель развития позвоночных, которая прозрачна во время развития, имеют ~70% генетической гомологии с человеком и высоко аннотированный геном, идеально подходящий для транскриптомного анализа. Из-за своего небольшого размера развивающиеся рыбки данио также позволяют компактно размещать серийные секции на нескольких биологических репликах. В данной работе мы сообщаем об оптимизированной фиксации, криосекции и надежном выравнивании нескольких образцов рыб в области визуализации мультиплексной платформы пространственной визуализации гибридизации in situ. С помощью этого метода рыбки данио в возрасте 15 дней после оплодотворения (dpf) по меньшей мере из 4 различных форм и до 174 срезов могут быть успешно криоссекированы, собраны в области визуализации 22 мм 10,5 мм (для пространственного транскриптомного предметного стекла in situ ) и обработаны одновременно. Основываясь на качестве сечения, выравнивании образца и размере образца на слайде, этот метод у рыбок данио оптимизирует вывод и стоимость образца пространственных транскриптомных методов.

Введение

Оценка пространственно различных паттернов экспрессии в тканях остается критически важной для нашего понимания влияния генома на развитие, рак и болезни ^1,2,3. Пространственная транскриптомика сочетает в себе методы мультиплексной экспрессии с пространственной регистрацией экспрессии в тканях. Термин «пространственная транскриптомика» был впервые придуман Столом^{и его} коллегами, в ходе которого образцы рака были исследованы с использованием секвенирования нового поколения in situ. С тех пор «пространственная транскриптомика» используется в качестве универсального решения для высокопроизводительных исследований экспрессии в сочетании с пространственной регистрацией. Несмотря на то, что это мощные инструменты, они также являются дорогостоящими мероприятиями, которые часто требуют больших институциональных инвестиций и лабораторных расходов для получения данных^. Стратегии минимизации затрат при сохранении высокого качества данных пользуются большим спросом.

Рыбки данио, Danio rerio, стали важной моделью системы для изучения биологии развития и предлагают средство для размножения анализов всего органа (и организма) позвоночных в ограниченном пространстве. Рыбки данио маленькие (4-6 мм как личинки и 2-3 см как взрослые особи) и могут отложить за один раз^сотни прозрачных икринок. Эмбрионы рыбок данио оплодотворяются внешне и быстро развиваются, что позволяет исследователям вводить трансгены на ранних стадиях развития, чтобы легко генерировать аллели прироста и потери функции^. Размещение нескольких образцов на одном предметном стекле является привлекательной стратегией для снижения затрат. Их высокая плодовитость и небольшой размер делают рыбок данио идеальным кандидатом для мультиплексных пространственных транскриптомных анализов, которые имеют ограниченное пространство для образцов⁸.

Криосекция личинок данио-рерио является сложной методикой. Многие пространственные транскриптомные платформы не были оптимизированы для парафиновых срезов рыбок данио и требуют криосекции при работе с рыбками данио в качестве модельного организма для сохранения структуры тканей и сохранения транскриптов РНК. Кроме того, небольшой размер рыбок данио затрудняет получение качественных криорезов и эффективный анализ нескольких образцов. Эта задача усложняется при работе с личинками данио-рерио, которые меньше и хрупкее своих взрослых собратьев. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы опишем метод, который надежно выравнивает несколько образцов и эффективно использует область визуализации платформ пространственной визуализации для получения множества высококачественных срезов на одном слайде, которые затем могут быть отображены и проанализированы платформами пространственной визуализации (рис. 1). В данном случае этот метод применяется к платформе пространственной транскриптомной визуализации.

протокол

Этот протокол соответствует рекомендациям комитета по уходу за животными и их использованию в учреждении Дартмутского колледжа.

1. Подготовка криостата

1. Охладите криостат до -22 °C и очистите внутренние поверхности криостата, смахнув мусор в емкость. Поместите все необходимые щетки и инструменты внутрь камеры.

2. Подготовка одноразовой основы формы

1. Подготовьте базовую форму (одноразовую пластиковую форму 37 мм, 24 мм, 5 мм) для выравнивания образца, проведя прямую линию через внутреннюю часть базовой формы перманентным маркером, чтобы использовать ее в качестве точки отсчета для выравнивания образца. Для достижения наилучших результатов поместите кусок лабораторной ленты на внутреннюю часть базовой формы в том месте, где должна проходить прямая линия (Рисунок 2A).
2. Нарисуйте точку на внутренней стороне формы основания возле левой или правой стенки, чтобы обеспечить правильную ориентацию образца во время криосекции (рис. 2B).
3. Измерьте желаемый угол реза с помощью транспортира и отметьте его на внутренней стороне базовой формы для каждого образца (Рисунок 2C).
4. Нанесите неглубокий слой замораживающей среды (оптическая когерентная томография [ОКТ]) на подготовленную форму-основу. Убедитесь, что замораживающей среды достаточно для покрытия образцов.
   1. Избегайте образования пузырьков воздуха при нанесении замораживающей среды, загрунтовав сопло бутылки со средой и добавив необходимое количество среды в один угол базовой формы перед смещением горизонтальной плоскости базовой формы таким образом, чтобы среда равномерно распределилась по всей поверхности.
   2. Медленно сжимайте бутылку при дозировании замораживающей среды.
5. Добавьте лед в стакан объемом 1 л, поместите форму для основы с замораживающей средой в ледяную баню и выдерживайте не менее 10 минут, чтобы охладить среду.

3. Приготовление сухого льда: ванна со 100% этанолом

1. Приготовьте ванну с сухим льдом и 100% этанолом в вытяжном шкафу, добавив одну часть 100% этанола к одной части сухого льда в ведре со льдом.
2. Используйте одноразовую алюминиевую тарелку или сложите алюминиевую фольгу в лодку, достаточно большую, чтобы в нее поместилась одноразовая форма для основания. Убедитесь, что блюдо или лодочка достаточно большая, чтобы форма для основания легла полностью ровно.
3. Поставьте блюдо или лодку в ванну и накройте ведро крышкой. Дайте ведру остыть 5-10 минут перед замораживанием образцов.

4. Усыпление образцов

1. Случайным образом выберите рыбок данио для разделов. Если выборки различаются по размеру, разделите их на группы по относительному размеру, чтобы облегчить точное выравнивание (подробнее см. обсуждение). Поместите более крупную рыбу и более мелкую рыбу в отдельную посуду.
2. Наполните стакан водой для рыбной системы и поместите стакан в ведро со льдом. Окружите стакан льдом.
3. Следите за температурой воды с помощью термометра. Дайте температуре стабилизироваться в пределах 2-4 °C.
4. Используйте сачок или ситечко, чтобы опустить одну группу рыб в воду с температурой 4 °C. Рыба должна быть полностью погружена в воду и не соприкасаться со льдом. Как только оперкулярное движение прекратится, добавьте лед в воду, чтобы она оставалась ниже 4 °C. Оставьте рыбу в воде при температуре 4 °C на 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте встраивание, выравнивание и мгновенное замораживание каждой группы усыпленных образцов перед усыплением следующей группы. Каждый раз заменяйте воду.

5. Встраивание и выравнивание

1. Соберите усыпленную рыбу после того, как она была погружена в воду с температурой 4 °C на 10 минут. Вытащите рыбу из воды с помощью щипцов с тонким наконечником, схватив ее за хвостовой плавник, и высушите, аккуратно прижав к впитывающей безворсовой салфетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для высококачественных секций крайне важно ограничить время между извлечением рыбы из воды с температурой 4 °C и мгновенной заморозкой
2. Работая с подготовленной базовой формой на ледяной бане под стереомикроскопом (10-кратное увеличение), поместите каждый образец в базовую форму по опорным точкам в правильной ориентации и аккуратно накройте образцы еще одним тонким слоем замораживающей среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не заполняйте всю форму замораживающей средой. Вместо этого используйте только тонкий слой, достаточный для покрытия всех образцов.
3. Используйте анатомическую точку отсчета, чтобы точно выровнять рыбу по линиям, отмеченным на внутренней стороне формы основания. Используйте щипцы с тонкими наконечниками, чтобы отрегулировать ориентацию каждой рыбы так, чтобы они были выровнены и находились в одной ориентации. Избегайте образования пузырьков в замораживающей среде, двигаясь медленно.
4. Положите кусок сухого льда на дно базовой формы под образцы до тех пор, пока они локально не замерзнут на месте. Держите горизонтальную плоскость основания формы на одном уровне, чтобы избежать смещения образцов от их опорных точек перед замораживанием с помощью сухого льда.
5. Поместите форму с образцами на алюминиевую лодку или блюдо в ванну с сухим льдом: 100% этанол. Убедитесь, что лодка плавает на поверхности ванны, а форма основания остается сухой. Накройте ванну крышкой и дайте образцам поплавать в течение 10 минут.
6. Заверните замороженную форму в фольгу и храните в морозильной камере при температуре -80 °C до готовности к разделке. Повторите шаги 4.2-5.6 для всех остальных групп.

6. Криосекция

1. Принесите замороженные формы для основания в предварительно охлажденный криостат для криосекции и поместите их в камеру криостата. Транспортируйте замороженные блоки в коробке с сухим льдом, чтобы предотвратить оттаивание.
2. Извлеките предметное стекло из хранилища и поместите его в предварительно охлажденный держатель предметного стекла. Храните держатель предметного стекла с пространственным изображением в криостатной камере при температуре -22 °C до тех пор, пока не будет готов к сбору срезов из интересующей области.
3. Извлеките замороженные образцы из базовой формы, а затем заморозьте их в патроне со свежей замораживающей средой. Заморозьте их на патроне так, чтобы режущая поверхность была обращена к лезвию.
4. Поместите свежее мелкое лезвие микротома в криостат.
5. Совместите форму с лезвием и обрежьте интересующую область (рекомендуемая толщина обрезки 20-50 мкм). Убедитесь, что маркировка, сделанная внутри формы, перенесена на замороженный блок образца, чтобы помочь определить местоположение внутри образцов.
6. Отрегулируйте форму на этапе обрезки таким образом, чтобы поверхность резки была параллельна эталонным маркировкам в замораживающей среде.
7. Соберите срезы на стандартное положительно заряженное предметное стекло микроскопа и проверьте их по светлому полю, чтобы убедиться, когда обрезка больше не требуется.
8. Извлеките предметное стекло из камеры криостата и поместите его в ледяную ванну при температуре 4 °C. Держите предметное стекло в держателе для слайдов. Следите за тем, чтобы горка не намокла.
9. Начать криосекцию (рекомендуется 10-14 мкм; Рисунок 3) и собирайте срезы на положительно заряженных предметных стеклах до тех пор, пока не будет достигнута область интереса в образцах. Проверьте срезы по светлому полю, чтобы убедиться, что интересующая область будет следующей секцией из формы.
10. Верните предметное стекло для пространственной визуализации отдельных клеток в камеру криостата. Извлеките слайд из держателя слайда и соберите разделы из точной области интереса на слайд пространственного изображения ряд за рядом, используя кисть с тонким наконечником, чтобы предотвратить скручивание секций.
    1. Вдавите уголок пустой, замерзающей среды в столик для ножа тыльной стороной кисти, чтобы секция оставалась плоской при захвате предметного стекла для сбора.
    2. Используйте верхнюю часть предметного стекла в качестве точки опоры, медленно опустите предметное стекло на секцию и дайте секциям прилипнуть к ползуну в течение 3 секунд, прежде чем снять затвор с ножевого столика.
    3. При сборе срезов в области изображения предметного стекла работайте слева направо и по возможности перекрывайте слои пустой, замерзающей среды.
    4. Используйте цветные бумажные рамки в качестве образца для размещения участков в области визуализации предметного стекла, если ткань плохо видна.
11. После сбора срезов из интересующей области поместите предметное стекло обратно в держатель предметного стекла. Если на предметном стекле больше нет образцов для сбора образцов, храните предметное стекло при температуре -80 °C в течение 2 недель, пока оно не будет готово для инструментального анализа с помощью платформы пространственной визуализации in situ . Если необходимо собрать срезы из нескольких форм, поместите предметное стекло для пространственного изображения обратно в ледяную ванну при температуре 4 °C и повторите шаги 6.3-6.11 со следующей формой.
12. Перед проведением анализа соберите срезы до и после срезов интересующей области из каждой формы на стандартном положительно заряженном предметном стекле микроскопа для окрашивания гематоксилином и эозином (HE), чтобы убедиться в достаточности выравнивания образца и качества среза.

7. Фиксация образца

1. Извлеките опорные стекла из криостата и высушите на воздухе при температуре RT в течение 30 минут, чтобы срезы прилипли к предметному стеклу.
2. Зафиксируйте срезы, поместив их в контейнер с 4% параформальдегидом (Таблица 1) на 20 минут.
3. Промойте срезы, поместив их в контейнер с дистиллированной водой на 3 минуты.
4. Продолжайте окрашивание HE или высушите и храните предметные стекла при температуре -80 °C для будущего окрашивания.

8. Окрашивание срезов HE

1. Обезвоживайте и очищайте секции, инкубируя предметные стекла в 100% этаноле в течение 2 минут, 95% (Таблица 2) этаноле в течение 2 минут, а затем в водопроводной воде в течение 1 минуты. Используйте штатив для окрашивания предметного стекла под микроскопом для переноса предметных стекол из ванны в ванну.
2. Окрашивают ядра и дифференцируют путем инкубации предметных стекол в гематоксилине в течение 2 мин 45 с, водопроводной воде в течение 1 мин, 0,3% подкисленном спирте (табл. 3) в течение 1 мин, а затем в проточной воде в течение 1 мин. Используйте штатив для окрашивания предметного стекла под микроскопом для переноса предметных стекол из ванны в ванну.
3. Окрашивание цитоплазматических компонентов и обезвоживание путем инкубации предметных стекол в эозине Y 1% в течение 45 с, 50% этаноле (Таблица 4) в течение 1 мин, 95% этаноле в течение 1 мин и 100% этаноле в течение 1 мин. Используйте штатив для окрашивания предметного стекла под микроскопом для переноса предметных стекол из ванны в ванну.
4. Очистите срезы, инкубируя предметные стекла в ксилоле в течение 1 минуты. Установите и накройте предметные стекла, нанеся каплю монтажного средства на верхнюю треть предметного стекла с помощью передаточной пипетки и медленно опустив покровное стекло поверх монтажного средства с помощью щипцов.

9. Пространственная транскриптомная визуализация и анализ разрезов

1. Извлеките слайды из хранилища при температуре -80 °C и получите изображение с помощью платформы пространственной визуализации in situ для пространственного транскриптомного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точные шаги, связанные с получением изображений, будут определяться платформой пространственной съемки.
2. Просмотрите метрики контроля качества пространственной транскриптомной платформы. Важными показателями для проверки являются количество обнаруженных клеток, медиана транскриптов на клетку, ядерные транскрипты на 100^мкм2 и общее количество высококачественных декодированных транскриптов каждого гена в наборе зондов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти показатели контроля качества не имеют универсальных пороговых значений, и ожидания в отношении этих пороговых значений будут варьироваться в зависимости от используемого образца и генетической панели.
3. Считывайте выходные данные об обнаруживаемых транскриптах РНК, определяйте, какие транскрипты имеют низкое качество, на основе показателей контроля качества эксперимента и отфильтровывайте транскрипты низкого качества. Проанализируйте остальные высококачественные расшифровки с точки зрения их пространственного расположения в разделе.
4. Просмотрите клеточную сегментацию секций и кластерных ячеек на основе экспериментальных интересов. Сравните транскрипты РНК в клеточных кластерах интересующей области в группах рыбок данио рерио разного возраста на одном и том же слайде.

Результаты

В этом методе (рис. 1) рыбка данио используется в качестве животной модели для зондирования пространственно разрешенных паттернов экспрессии генов. Эффективное криосекционирование личинок данио-рерио для пространственной визуализации является слож?...

Обсуждение

В этом отчете представлены подробные решения многих технических проблем, связанных с рыбками данио рерио в качестве модельного организма в пространственном транскриптомном анализе во время разработки. Для решения этих проблем наша компактная компоновка образцов о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide