空間トランスクリプトーム解析のためのゼブラフィッシュ幼生切片の空間コンパクト配置

要約

ここでは、複数のゼブラフィッシュ(Danio rerio)の幼生サンプルを整列させて凍結切片化し、それらを1枚のスライドに集めて空間的トランスクリプトーム解析を行う方法を紹介します。

要約

空間的トランスクリプトーム技術は、空間的に登録された遺伝子発現パターンを視覚化するための生物医学研究における洗練されたツールです。空間イメージングプラットフォームを使用した複数のサンプルのイメージングと分析には、コストがかかる場合があります。これらの試験を複数の実験条件で実施すると、発生研究で見られるように、さらにコストが増加します。コストを削減するために、この研究では、発生研究のための空間的トランスクリプトーム標本配置の技術と戦略を最適化しようとしました。本研究では、発生時に透明である確立された発生脊椎動物モデルであり、ヒトと~70%の遺伝的相同性を持ち、トランスクリプトーム解析に最適な高アノテーションゲノムを持つゼブラフィッシュを利用しました。ゼブラフィッシュはサイズが小さいため、発育中のゼブラフィッシュは、いくつかの生物学的複製に連続切片をコンパクトに配置することもできます。ここでは、マルチプレックス in situハイブリダイゼーション空間イメージングプラットフォームのイメージングエリア内での複数の魚サンプルの最適化された固定、凍結切片、および信頼性の高いアライメントを報告します。この方法では、受精後15日齢(dpf)のゼブラフィッシュを、少なくとも4つの異なる型と最大174の切片から凍結切片化し、22 mm 10.5 mmのイメージング領域内( in situ 空間トランスクリプトームスライド用)で採取し、同時に処理することができます。ゼブラフィッシュのこの方法は、切片の品質、サンプルのアライメント、スライドあたりのサンプルサイズに基づいて、空間トランスクリプトーム法のアウトプットとサンプルあたりのコストを最適化します。

概要

組織における空間的に異なる発現パターンの評価は、発生、がん、および疾患におけるゲノムの影響を理解するために依然として重要です^1,2,3。空間的トランスクリプトミクスは、マルチプレックス発現技術と組織における発現の空間的レジストレーションを組み合わせたものです。「空間的トランスクリプトミクス」は、Ståhl ら^によって最初に造られた4、マウントされたがん検体がin situ次世代シーケンシングを使用してプローブされました。それ以来、「空間的トランスクリプトミクス」は、空間的レジストレーションと組み合わせたハイスループット発現研究のキャッチオールとして使用されてきました。これらは強力なツールである一方で、データを生成する前に多額の機関投資やラボのコストを必要とすることが多い高価な事業でもあります⁵。高品質のデータを保持しながらコストを最小限に抑える戦略は、高い需要があります。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発生生物学を研究するための重要なモデルシステムとなり、限られたスペースで脊椎動物の全臓器(および生物)の分析を倍増させる手段を提供しています。ゼブラフィッシュは小型(幼虫は4-6 mm、成魚は2-3 cm)で、一度に数百個の透明な卵を産むことができる⁶。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精し、急速に発達するため、研究者は発生の初期段階で導入遺伝子を導入し、機能獲得対立遺伝子と機能喪失対立遺伝子を容易に生成することができます⁷。1枚のスライドに複数の試料をはめ込むことは、コスト削減のための魅力的な戦略です。ゼブラフィッシュは繁殖力が高く、サイズが小さいため、標本のスペースが限られている空間トランスクリプトーミクスアッセイのマルチプレックス化に理想的な候補^です8。

ゼブラフィッシュの幼生の凍結切片は、難しい技術です。多くの空間的トランスクリプトームプラットフォームは、ゼブラフィッシュのパラフィン切片用に最適化されておらず、ゼブラフィッシュをモデル生物として扱う際には、組織構造を保存し、RNA転写物を保持するために凍結切片が必要です。さらに、ゼブラフィッシュはサイズが小さいため、高品質の凍結切片を入手し、複数のサンプルを効果的に分析することが困難です。この作業は、成魚よりも小さくて壊れやすいゼブラフィッシュの幼生を扱う場合、より困難になります。これらの課題を克服するために、複数のサンプルを確実にアライメントし、空間イメージングプラットフォームのイメージング領域を効率的に利用して、1枚のスライド上に多くの高品質な切片を取得し、それを空間イメージングプラットフォームでイメージングおよび分析できる方法について説明します(図1)。この例では、この方法を空間トランスクリプトームイメージングプラットフォームに適用します。

プロトコル

このプロトコルは、ダートマス大学の施設内動物管理および使用委員会のガイドラインに従っています。

1. クライオスタットの準備

1. クライオスタットを-22°Cに冷却し、破片をレセプタクルにブラッシングしてクライオスタットの内面を清掃します。必要なすべてのブラシとツールをチャンバー内に配置します。

2.使い捨てベースモールドの準備

1. ベースモールドの内側に油性マーカーで直線を描き、サンプルアライメント用のベースモールド(37mm、24mm、5mm使い捨てプラスチックモールド)を準備し、サンプルアライメントの基準点として使用します。最良の結果を得るには、線を引く前に、直線があるべきベースモールドの内側にラボテープを置きます(図2A)。
2. ベースモールドの内側の左壁または右壁の近くに点を描き、クライオセクショニング中にサンプルの適切な向きを確保します(図2B)。
3. 分度器で目的の切断角度を測定し、これを各サンプルのベースモールドの内側に印を付けます(図2C)。
4. 準備したベース型に、凍結(光干渉断層撮影[OCT])媒体の浅い層を塗布します。サンプルを覆うのに十分な凍結媒体があることを確認してください。
   1. 凍結媒体を塗布するときは、媒体ボトルのノズルを下塗りし、ベース金型の1つのコーナーに必要な量の媒体を追加してから、ベース金型の水平面をずらして、媒体が全面に均一に分布するようにして、気泡を避けてください。
   2. 凍結媒体を分配するときは、ボトルをゆっくりと絞ってください。
5. 1Lビーカーに氷を加え、ベース型を凍結培地と一緒に氷浴に入れ、少なくとも10分間インキュベートして培地を冷却します。

3.ドライアイスの準備:100%エタノールバス

1. アイスバケツのドライアイス1部に100%エタノール1部を加えて、ドラフトにドライアイスと100%エタノール浴を準備します。
2. 使い捨てのアルミ皿を使用するか、アルミホイルを折りたたんで、使い捨てのベース型に収まるほどの大きさのボートに入れます。皿またはボートが、ベースモールドが完全に平らになるのに十分な大きさであることを確認してください。
3. 皿やボートをお風呂に入れ、バケツを覆います。バケツが冷えるまで5〜10分待ってから、サンプルを凍結します。

4.サンプルの安楽死

1. ゼブラフィッシュをランダムに選択して切片化します。サンプルのサイズが異なる場合は、正確な位置合わせを容易にするために、相対的なサイズでグループに分けます(詳細については、ディスカッションを参照してください)。大きな魚と小さな魚を別々の皿に入れます。
2. ビーカーに魚系の水を入れ、ビーカーを氷のバケツに入れます。ビーカーを氷で囲みます。
3. 温度計で水の温度を監視します。温度を2〜4°Cの間で安定させます。
4. ネットまたはストレーナーを使用して、1つの魚のグループを4°Cの水に入れます。魚は氷と接触せず、完全に水に浸す必要があります。手術の動きが止まったら、水に氷を加えて、水が4°C未満に保たれるようにします。 魚を4°Cの水に10分間置いておきます。
   注:次のグループを安楽死させる前に、安楽死させたサンプルの各グループの埋め込み、位置合わせ、および瞬間凍結を続行してください。毎回水を交換してください。

5. 埋め込みとアライメント

1. 安楽死させた魚を4°Cの水に10分間沈めた後、魚を採取します。尾びれで魚をつかんで先端の細い鉗子で魚を水から取り出し、吸収性のある糸くずの出ないワイプにそっと押し付けて乾かします。
   注:高品質のセクションでは、4°Cの水から魚を取り出してから瞬間冷凍するまでの時間を制限することが重要です
2. 実体顕微鏡(10倍倍)の氷浴で準備したベース型を操作し、各サンプルを基準点に沿って正しい向きでベース型に配置し、サンプルを別の薄い凍結媒体の層で静かに覆います。
   注意: 金型全体に凍結媒体を充填しないでください。代わりに、すべてのサンプルを覆うのに十分な薄い層のみを使用してください。
3. 解剖学的な基準点を使用して、魚をベースモールドの内側にマークされた線に正確に位置合わせします。先端の細い鉗子を使用して、各魚の向きを調整し、同じ向きになるようにします。ゆっくりと移動して、凍結媒体に気泡を作らないようにしてください。
4. サンプルが所定の位置に局所的に凍結されるまで、サンプルの下のベースモールドの底にドライアイスを塗布します。ベースモールドの水平面を水平に保ち、ドライアイスで所定の位置に凍結する前にサンプルを基準点からずらさないようにします。
5. サンプルを入れたベースモールドを、ドライアイス:100%エタノールバスのアルミボートまたは皿に置きます。ボートがバスの表面に浮いており、ベースモールドが乾いたままであることを確認してください。浴に蓋をして、サンプルを10分間浮かべます。
6. 凍結したベース型をホイルで包み、切断する準備ができるまで-80°Cの冷凍庫で保管します。残りのグループに対して手順 4.2 から 5.6 を繰り返します。

6. クライオセクショニング

1. 凍結したベース型を予冷したクライオスタットに持ち込んでクライオセクショニングを行い、クライオスタットチャンバーに入れます。凍結したブロックは、解凍を防ぐためにドライアイスを入れた箱に入れて輸送します。
2. in situ空間イメージングスライドを保管庫から取り出し、事前に冷却したスライドホルダーに入れます。空間イメージングスライド付きのスライドホルダーは、関心領域から切片を収集する準備ができるまで、-22°Cのクライオスタットチャンバーに保管します。
3. 凍結したサンプルをベースモールドから取り出し、新鮮な凍結培地を入れたチャックで凍結します。それらをチャックに凍結して、切断面がブレードに面するようにします。
4. 新鮮で細かいミクロトームブレードをクライオスタットに入れます。
5. 金型をブレードに合わせ、対象領域をトリムします(推奨されるトリム厚さ20〜50μm)。金型内で行われたマーキングが凍結したサンプルブロックに転写されていることを確認して、サンプル内の位置を特定するのに役立ちます。
6. トリミング段階では、切断面が凍結媒体の参照マーキングと平行になるように金型を調整します。
7. 切片を標準的な正電荷の顕微鏡スライドに集め、明視野でチェックして、トリミングが不要になったかどうかを確認します。
8. クライオスタットチャンバーから空間イメージングスライドを取り出し、4°Cの氷浴に入れます。スライドはスライドホルダーに入れておきます。スライドが濡れないように注意してください。
9. 凍結切片を開始します(推奨10-14μm; 図3)そして、サンプルの関心領域に達するまで、正に帯電したスライド上に切片を収集します。明視野でセクションをチェックして、関心領域が金型の次のセクションになることを確認します。
10. シングルセル空間イメージングスライドをクライオスタットチャンバーに戻します。スライドホルダーからスライドを取り外し、先端の細いペイントブラシを使用して、正確な関心領域からセクションを空間イメージングスライドに行ごとに収集し、セクションがロールアップしないようにします。
    1. 空の凍結媒体の角を絵筆の裏側でナイフステージに押し込み、スライドをつかんで収集するときにセクションが平らになるようにします。
    2. スライドの上部をピボットポイントとして使用し、スライドをゆっくりとセクションに下げ、セクションがスライドに3秒間付着するまで待ってから、スライドをナイフステージから持ち上げます。
    3. スライドのイメージング領域で切片を収集するときは左から右に作業し、可能な場合は空の凍結媒体の層を重ねます。
    4. 色付きの紙の境界線を基準にして、組織が見にくい場合はスライドのイメージング領域内にセクションを配置します。
11. 対象領域から切片を収集した後、スライドをスライドホルダーに戻します。空間イメージングスライドに収集するサンプルがなくなった場合は、スライドを-80°Cで最大2週間保存し、 in situ 空間イメージングプラットフォームでの装置分析の準備が整います。複数の型から切片を収集する必要がある場合は、空間イメージングスライドを4°Cの氷浴に戻し、次の型で手順6.3〜6.11を繰り返します。
12. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色用の標準的な正電荷顕微鏡スライド上で、各型から関心領域切片の前後の切片を収集し、サンプルのアライメントと切片の品質が十分であることを確認してから、分析を進めます。

7. サンプルの固定

1. 参照スライドをクライオスタットから取り出し、RTで30分間風乾して切片をスライドに接着します。
2. 切片を4%パラホルムアルデヒド(表1)の入ったスライド容器に20分間入れて固定します。
3. 切片を蒸留水を入れたスライド容器に3分間入れて洗浄します。
4. HE染色を続けるか、乾燥させてスライドを-80°Cで保存し、将来の染色に備えてください。

8. 切片のHE染色

1. スライドを100%エタノールで2分間、95%(表2)エタノールで2分間、次に水道水で1分間インキュベートすることにより、切片を脱水して洗浄します。顕微鏡スライド染色ラックを使用して、スライドを浴から浴に移します。
2. スライドをヘマトキシリンで2分間45秒間、水道水で1分間、0.3%酸性アルコール(表3)で1分間インキュベートし、水道水を1分間流して、核を染色し、分化させます。顕微鏡スライド染色ラックを使用して、スライドを浴から浴に移します。
3. 細胞質成分を染色し、スライドをEosin Y 1%で45秒間、50%エタノール(表4)で1分間、95%エタノールで1分間、および100%エタノールで1分間インキュベートして脱水します。顕微鏡スライド染色ラックを使用して、スライドを浴から浴に移します。
4. スライドをキシレンで1分間インキュベートして、切片を透明にします。転写ピペットでスライドの上部3分の1に封入剤を滴下し、鉗子で封入剤の上にカバースリップをゆっくりと下げて、スライドを取り付けて覆います。

9. 切片の空間的トランスクリプトームイメージングと解析

1. -80°Cの保管からイメージングスライドを取り出し、空間トランスクリプトーム解析用の in situ 空間イメージングプラットフォームでイメージングします。
   注:イメージングに関連する正確な手順は、空間イメージングプラットフォームによって決定されます。
2. 空間トランスクリプトームプラットフォームの品質管理指標を確認します。チェックすべき重要な指標は、検出された細胞数、細胞あたりの転写産物の中央値、100 μm²あたりの核転写産物、およびプローブセット内の各遺伝子の高品質なデコード転写産物の合計です。
   注:これらの品質管理指標には普遍的な閾値がなく、これらの閾値に対する期待値は、使用するサンプルと遺伝子パネルによって異なります。
3. 検出可能なRNA転写産物のデータ出力を読み取り、実験の品質管理指標に基づいてどの転写産物が低品質であるかを判断し、低品質の転写産物を除外します。残りの高品質のトランスクリプトを、セクション内の空間配置に関連して分析します。
4. 実験的な関心に基づいて、切片とクラスター細胞の細胞セグメンテーションを表示します。関心領域の細胞クラスター内のRNA転写産物を、同じスライド上の異なる年齢のゼブラフィッシュのグループ間で比較します。

結果

この方法(図1)では、ゼブラフィッシュを動物モデルとして用い、空間的に分解された遺伝子発現パターンを探索します。ゼブラフィッシュの幼生を効率的に凍結切片化して空間イメージングを行うことは困難です。切片は、組織構造と検出可能な遺伝子を保持するために高品質でなければなりません(図4)。空間効率の高い...

ディスカッション

本稿では、ゼブラフィッシュをモデル生物として持つ開発中の空間トランスクリプトーム解析における多くの技術的課題について、詳細な解決策を提供します。これらの課題に対処するために、当社のコンパクトな試料配置は、新しい空間トランスクリプトームプラットフォーム¹のコストを最適化します。ゼブラフィッシュの幼生を凍結切片で空?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide