Mekansal transkriptomik analiz için larva zebra balığı bölümlerinin mekansal olarak kompakt düzenlenmesi

Özet

Burada, birden fazla Zebra Balığı (Danio rerio) larva örneğini hizalamak ve kriyoseksiyona tabi tutmak ve bunları mekansal transkriptomik analiz için tek bir slaytta toplamak için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Mekansal transkriptomik teknikler, biyomedikal araştırmalarda mekansal olarak kaydedilmiş gen ekspresyon modellerini görselleştirmek için gelişmiş bir araçtır. Mekansal görüntüleme platformları ile birden fazla numunenin görüntülenmesi ve analizi maliyetli olabilir. Bu testlerin gelişimsel çalışmalarda da görüldüğü gibi birden fazla deney koşulu üzerinden yapılması maliyetleri daha da artırmaktadır. Maliyetleri azaltmak için bu çalışma, gelişimsel çalışmalar için uzamsal transkriptomik örnek düzenleme tekniklerini ve stratejilerini optimize etmeye çalıştı. Burada, çalışma, gelişim sırasında şeffaf olan, insanlara ~% 70 genetik homolojiye sahip olan ve transkriptomik analiz için ideal olan yüksek açıklamalı bir genoma sahip, köklü bir gelişimsel omurgalı modeli olan zebra balıklarını kullandı. Küçük boyutları nedeniyle, zebra balığı geliştirmek, seri bölümlerin birkaç biyolojik kopya boyunca kompakt bir şekilde yerleştirilmesine de izin verir. Burada, bir multipleks in situ hibridizasyon mekansal görüntüleme platformunun görüntüleme alanı içinde birden fazla balık örneğinin optimize edilmiş fiksasyonunu, kriyoseksiyonunu ve güvenilir hizalamasını rapor ediyoruz. Bu yöntemle, en az 4 farklı küften ve 174 bölüme kadar zebra balığı döllenmeden 15 gün sonra (dpf) başarılı bir şekilde kriyoseksiyone alınabilir, 22 mm 10,5 mm'lik görüntüleme alanı içinde toplanabilir ( yerinde mekansal transkriptomik slayt için) ve aynı anda işlenebilir. Bölüm kalitesine, numune hizalamasına ve slayt başına numune boyutuna bağlı olarak, zebrafish'teki bu yöntem, uzamsal transkriptomik tekniklerin çıktısını ve numune başına maliyetini optimize eder.

Giriş

Dokudaki uzamsal olarak farklı ekspresyon modellerinin değerlendirilmesi, gelişim, kanser ve hastalıktaki genomik etkileri anlamamız için kritik öneme sahiptir ^1,2,3. Uzamsal transkriptomik, çoğullanmış ekspresyon tekniklerini dokulardaki ekspresyonun uzamsal kaydı ile birleştirir. "Mekansal transkriptomik" ilk olarak Ståhl ve meslektaşları⁴ tarafından icat edildi ve burada monte edilmiş kanser örnekleri yerinde yeni nesil dizileme kullanılarak incelendi. O zamandan beri, "uzamsal transkriptomik", uzamsal kayıt ile birlikte yüksek verimli ifade çalışmaları için her şeyi kapsayan bir yöntem olarak kullanılmıştır. Bunlar güçlü araçlar olmakla birlikte, aynı zamanda verilerin oluşturulabilmesi için genellikle büyük kurumsal yatırım ve laboratuvar maliyetleri gerektiren pahalı girişimlerdir⁵. Yüksek kaliteli verileri korurken maliyeti en aza indirmeye yönelik stratejiler yüksek talep görmektedir.

Zebra balığı, Danio rerio, gelişim biyolojisi çalışmaları için önemli bir model sistem haline gelmiştir ve omurgalı tüm organ (ve organizma) analizlerini sınırlı bir alanda çoğaltmanın bir yolunu sunmaktadır. Zebra balığı küçüktür (larva olarak 4-6 mm ve yetişkin olarak 2-3 cm) ve bir seferde yüzlerce şeffaf yumurta bırakabilir⁶. Zebra balığı embriyoları dışarıdan döllenir ve hızla gelişir, bu da araştırmacıların gelişimin erken aşamalarında kolayca fonksiyon kazancı ve kaybı alelleri oluşturmak için transgenleri tanıtmalarına olanak tanır⁷. Tek bir slayta birden fazla numune sığdırmak, maliyetleri azaltmak için çekici bir stratejidir. Yüksek doğurganlıkları ve küçük boyutları, zebra balıklarını, örnekler için kısıtlı alana sahip olan uzamsal transkriptomik tahlilleri çoğullamak için ideal bir aday yapar⁸.

Zebra balığı larvalarının kriyoseksiyonu zorlu bir tekniktir. Birçok uzamsal transkriptomik platform, zebra balığı parafin kesitleri için optimize edilmemiştir ve doku yapısını korumak ve RNA transkriptlerini korumak için model organizma olarak zebra balığı ile çalışırken kriyoseksiyonlar gerektirir. Ek olarak, zebra balığının küçük boyutu, kaliteli kriyoseksiyonlar elde etmeyi ve birden fazla numuneyi etkili bir şekilde analiz etmeyi zorlaştırır. Yetişkin muadillerinden daha küçük ve daha kırılgan olan zebra balığı larvaları ile çalışırken bu görev daha zor hale gelir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birden fazla numuneyi güvenilir bir şekilde hizalayan ve daha sonra uzamsal görüntüleme platformları tarafından görüntülenebilen ve analiz edilebilen tek bir slayt üzerinde birçok yüksek kaliteli bölüm elde etmek için uzamsal görüntüleme platformlarının görüntüleme alanını verimli bir şekilde kullanan bir yöntem açıklıyoruz (Şekil 1). Bu durumda, bu yöntem uzamsal bir transkriptomik görüntüleme platformuna uygulanır.

Protokol

Bu protokol, Dartmouth College'ın kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Kriyostatın hazırlanması

1. Kriyostatı -22 °C'ye soğutun ve kriyostatın iç yüzeylerini, kalıntıları hazneye fırçalayarak temizleyin. Gerekli tüm fırçaları ve aletleri haznenin içine yerleştirin.

2. Tek kullanımlık taban kalıbının hazırlanması

1. Numune hizalaması için bir referans noktası olarak kullanmak üzere kalıcı bir işaretleyici ile bir temel kalıbın içi boyunca düz bir çizgi çizerek numune hizalaması için bir taban kalıbı (37 mm 24 mm 5 mm tek kullanımlık plastik kalıp) hazırlayın. En iyi sonuçlar için bir çizgi çizmeden önce düz çizginin olması gereken taban kalıbının içine bir parça laboratuvar bandı yerleştirin (Şekil 2A).
2. Kriyoseksiyon sırasında uygun numune oryantasyonunu sağlamak için taban kalıbının iç kısmına sol veya sağ duvara yakın bir nokta çizin (Şekil 2B).
3. İstenen kesme açısını bir iletki ile ölçün ve bunu her numune için taban kalıbının iç kısmında işaretleyin (Şekil 2C).
4. Hazırlanan taban kalıbına sığ bir dondurma tabakası (optik koherens tomografi [OCT]) ortamı uygulayın. Numuneleri kaplamaya yetecek kadar dondurma ortamı olduğundan emin olun.
   1. Orta şişenin ağzını astarlayarak ve taban kalıbının yatay düzlemini kaydırmadan önce taban kalıbının bir köşesine gerekli miktarda ortam ekleyerek dondurma ortamını uygularken hava kabarcıklarından kaçının, böylece ortam tüm yüzeye eşit olarak dağıtılır.
   2. Dondurma ortamını dağıtırken şişeyi yavaşça sıkın.
5. 1 L'lik bir behere buz ekleyin, dondurma ortamlı taban kalıbını buz banyosuna yerleştirin ve ortamı soğutmak için en az 10 dakika inkübe edin.

3. Kuru buz hazırlama:% 100 etanol banyosu

1. Bir buz kovasındaki bir kısım kuru buza bir kısım %100 etanol ekleyerek çeker ocakta kuru buz ve %100 etanol banyosu hazırlayın.
2. Tek kullanımlık bir alüminyum tabak kullanın veya alüminyum folyoyu tek kullanımlık bir taban kalıbına sığacak kadar büyük bir tekneye katlayın. Çanak veya teknenin, taban kalıbının tamamen düz durması için yeterince büyük olduğundan emin olun.
3. Çanağı veya tekneyi banyoya yerleştirin ve kovayı kapatın. Numuneleri dondurmadan önce kovanın soğuması için 5-10 dakika bekleyin.

4. Ötenazi örnekleri

1. Bölümlere ayırmak için rastgele zebra balığı seçin. Örneklerin boyutları değişiyorsa, doğru hizalamayı kolaylaştırmak için bunları göreceli boyuta göre gruplara ayırın (ayrıntılar için tartışmaya bakın). Büyük balıkları ve küçük balıkları ayrı tabaklara koyun.
2. Bir beheri balık sistemi suyuyla doldurun ve kabı bir buz kovasına koyun. Beheri buzla çevreleyin.
3. Suyun sıcaklığını bir termometre ile izleyin. Sıcaklığın 2-4 °C arasında sabitlenmesine izin verin.
4. Bir grup balığı 4 °C suya koymak için bir ağ veya süzgeç kullanın. Balıklar tamamen suya batırılmalı ve buzla temas ettirilmemelidir. Operküler hareket durduğunda, 4 °C'nin altında kalmasını sağlamak için suya buz ekleyin. Balıkları 4 °C suda 10 dakika bekletin.
   NOT: Bir sonraki gruba ötenazi yapmadan önce her bir ötenazi örneği grubunun gömülmesi, hizalanması ve hızlı dondurulması ile devam edin. Her seferinde suyu değiştirin.

5. Gömme ve hizalama

1. Ötenazi yapılmış balıkları 10 dakika boyunca 4 °C suya batırıldıktan sonra toplayın. Balıkları ince uçlu forseps ile kuyruk yüzgecinden tutarak sudan çıkarın ve emici, tüy bırakmayan bir mendile hafifçe bastırarak kurulayın.
   NOT: Yüksek kaliteli bölümler için, balıkların 4 °C sudan çıkarılması ile hızlı dondurma arasındaki süreyi sınırlamak çok önemlidir
2. Hazırlanan taban kalıbı ile bir buz banyosunda stereomikroskop altında (10x büyütme) çalışarak, her bir numuneyi referans noktaları boyunca doğru yönde temel kalıba yerleştirin ve numuneleri başka bir ince dondurma ortamı tabakası ile nazikçe kaplayın.
   NOT: Tüm kalıbı donma ortamı ile doldurmayın. Bunun yerine, yalnızca tüm numuneleri kaplayacak kadar ince bir tabaka kullanın.
3. Balıkları taban kalıbının iç kısmında işaretlenmiş çizgilere hassas bir şekilde hizalamak için anatomik bir referans noktası kullanın. Her balığın yönünü aynı hizada ve aynı yönde olacak şekilde ayarlamak için ince uçlu forseps kullanın. Yavaş hareket ederek donma ortamında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
4. Numunelerin altındaki taban kalıbının altına, yerel olarak dondurulana kadar bir parça kuru buz uygulayın. Kuru buzla donmadan önce numunelerin referans noktalarından kaymasını önlemek için temel kalıp seviyesinin yatay düzlemini koruyun.
5. Numunelerle birlikte taban kalıbını kuru buz:% 100 etanol banyosunda alüminyum tekne veya tabağa yerleştirin. Teknenin banyo yüzeyinde yüzdüğünden ve taban kalıbının kuru kaldığından emin olun. Banyoyu örtün ve numunelerin 10 dakika yüzmesine izin verin.
6. Donmuş taban kalıbını folyoya sarın ve bölümlere ayrılmaya hazır olana kadar -80 °C dondurucuda saklayın. Kalan gruplar için 4.2-5.6 adımlarını tekrarlayın.

6. Kriyoseksiyon

1. Donmuş baz kalıplarını kriyoseksiyon için önceden soğutulmuş kriyostata getirin ve kriyostat odasına yerleştirin. Çözülmeyi önlemek için donmuş blokları kuru buzlu bir kutuda taşıyın.
2. Yerinde uzamsal görüntüleme slaytını depodan çıkarın ve önceden soğutulmuş bir slayt tutucusuna yerleştirin. Uzamsal görüntüleme slaytlı sürgü tutucuyu, ilgilenilen bölgeden kesitleri toplamaya hazır olana kadar -22 °C kriyostat odasında saklayın.
3. Dondurulmuş numuneleri taban kalıbından çıkarın ve ardından taze bir dondurma ortamı olan bir aynada dondurun. Kesme yüzeyi bıçağa bakacak şekilde aynanın üzerine dondurun.
4. Kriyostata yeni, ince bir mikrotom bıçağı yerleştirin.
5. Kalıbı bıçağa hizalayın ve ilgilenilen bölgeyi kesin (önerilen trim kalınlığı 20-50 μm). Numuneler içindeki konumu tanımlamaya yardımcı olmak için kalıbın içinde yapılan işaretlerin donmuş numune bloğuna aktarıldığından emin olun.
6. Düzeltme aşamasında kalıbı, kesme yüzeyi dondurma ortamındaki referans işaretlerine paralel olacak şekilde ayarlayın.
7. Kesitleri standart pozitif yüklü bir mikroskop lamı üzerine toplayın ve kırpmanın artık gerekli olmadığını doğrulamak için parlak alan ile kontrol edin.
8. Uzamsal görüntüleme slaytını kriyostat odasından çıkarın ve 4 °C'lik bir buz banyosuna yerleştirin. Slaytı sürgü tutucusunda tutun. Kaydırağın ıslanmadığından emin olun.
9. Kriyoseksiyona başlayın (önerilen 10-14 μm; Şekil 3) ve numunelerdeki ilgilenilen bölgeye ulaşılana kadar bölümleri pozitif yüklü slaytlar üzerinde toplayın. İlgilenilen bölgenin kalıptan bir sonraki bölüm olacağını onaylamak için brightfield'a göre bölümleri kontrol edin.
10. Tek hücreli uzamsal görüntüleme slaytını kriyostat odasına geri getirin. Slaytı slayt tutucusundan çıkarın ve bölümlerin yuvarlanmasını önlemek için ince uçlu bir boya fırçası kullanarak tam ilgi alanındaki bölümleri uzamsal görüntüleme slaydına satır satır toplayın.
    1. Boş, dondurucu ortamın bir köşesini boya fırçasının arka tarafıyla bıçak aşamasına bastırın, böylece slaytı toplamak için tutarken bölüm düz kalır.
    2. Sürgünün üst kısmını pivot noktası olarak kullanın, sürgüyü yavaşça bölümün üzerine indirin ve sürgüyü bıçak aşamasından kaldırmadan önce bölümlerin 3 saniye boyunca sürgüne yapışmasına izin verin.
    3. Slaytın görüntüleme alanındaki bölümleri toplarken soldan sağa doğru çalışın ve mümkün olduğunda boş, donma ortamının katmanlarını üst üste getirin.
    4. Dokunun görülmesi zorsa, slaytın görüntüleme alanı içindeki bölümleri yerleştirmek için referans olarak renkli kağıt kenarlıkları kullanın.
11. İlgilenilen bölgeden bölümleri topladıktan sonra, sürgüyü tekrar sürgü tutucusuna yerleştirin. Uzamsal görüntüleme slaytı üzerinde toplanacak başka numune yoksa, slaytı yerinde uzamsal görüntüleme platformuyla cihaz analizine hazır olana kadar -80 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. Bölümlerin birden fazla kalıptan toplanması gerekiyorsa, uzamsal görüntüleme slaytını 4 °C buz banyosuna geri koyun ve bir sonraki kalıpla 6.3-6.11 adımlarını tekrarlayın.
12. Analize devam etmeden önce numune hizalamasının ve kesit kalitesinin yeterli olup olmadığını kontrol etmek için hematoksilen ve eozin (HE) boyama için standart bir pozitif yüklü mikroskop lamı üzerinde her kalıptan ilgilenilen bölge bölümlerinden önce ve sonra bölümleri toplayın.

7. Numunenin sabitlenmesi

1. Referans slaytları kriyostattan çıkarın ve bölümleri slayta yapıştırmak için RT'de 30 dakika havayla kurutun.
2. Bölümleri 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit içeren bir slayt kabına (Tablo 1) yerleştirerek sabitleyin.
3. Bölümleri 3 dakika boyunca damıtılmış su ile sürgülü bir kaba koyarak yıkayın.
4. HE boyamaya devam edin veya kurutun ve gelecekteki boyama için slaytları -80 °C'de saklayın.

8. Bölümlerin boyanması

1. Slaytları 2 dakika% 100 etanol, % 95 (Tablo 2) etanol içinde 2 dakika ve ardından 1 dakika musluk suyunda inkübe ederek bölümleri kurutun ve temizleyin. Slaytları banyodan banyoya aktarmak için bir mikroskop slayt boyama rafı kullanın.
2. Slaytları Hematoksilen içinde 2 dakika 45 s, musluk suyunda 1 dakika, %0.3 asitlenmiş alkolde (Tablo 3) 1 dakika ve ardından 1 dakika musluk suyu akıtarak çekirdekleri boyayın ve farklılaştırın. Slaytları banyodan banyoya aktarmak için bir mikroskop slayt boyama rafı kullanın.
3. Sitoplazmik bileşenleri boyayın ve slaytları Eozin Y% 1'de 45 s, %50 etanolde (Tablo 4) 1 dakika, %95 etanolde 1 dakika ve %100 etanolde 1 dakika inkübe ederek dehidrat edin. Slaytları banyodan banyoya aktarmak için bir mikroskop slayt boyama rafı kullanın.
4. Slaytları Ksilen içinde 1 dakika inkübe ederek bölümleri temizleyin. Bir transfer pipeti ile sürgünün üst üçte birlik kısmına bir damla montaj ortamı uygulayarak ve forseps ile montaj ortamının üzerine bir lamel yavaşça indirerek kızakları monte edin ve örtün.

9. Mekansal transkriptomik görüntüleme ve kesitlerin analizi

1. Görüntüleme slaytlarını -80 °C depolama alanından çıkarın ve uzamsal transkriptomik analiz için yerinde uzamsal görüntüleme platformuyla görüntü alın.
   NOT: Görüntülemede yer alan kesin adımlar, uzamsal görüntüleme platformu tarafından belirlenecektir.
2. Mekansal transkriptomik platformun kalite kontrol metriklerini gözden geçirin. Kontrol edilmesi gereken önemli metrikler, tespit edilen hücre sayısı, hücre başına medyan transkriptler, 100^μm2 başına nükleer transkriptler ve prob setindeki her bir genin toplam yüksek kaliteli kodu çözülmüş transkriptleridir.
   NOT: Bu kalite kontrol metriklerinin evrensel eşikleri yoktur ve bu eşiklere ilişkin beklentiler, kullanılan örneğe ve gen paneline bağlı olarak değişecektir.
3. Tespit edilebilir RNA transkriptlerinin veri çıktısını okuyun, deneyin kalite kontrol metriklerine göre hangi transkriptlerin düşük kaliteli olduğunu belirleyin ve düşük kaliteli transkriptleri filtreleyin. Kalan yüksek kaliteli transkriptleri, bölüm içindeki mekansal düzenlemeleriyle ilişkili olarak analiz edin.
4. Deneysel ilgi alanlarına dayalı olarak bölümlerin ve küme hücrelerinin hücresel segmentasyonunu görüntüleyin. Aynı slaytta farklı yaşlardaki zebra balığı gruplarındaki ilgilenilen bölgenin hücre kümeleri içindeki RNA transkriptlerini karşılaştırın.

Sonuçlar

Bu yöntemde (Şekil 1), zebra balığı, uzamsal olarak çözülmüş gen ekspresyon modellerini araştırmak için bir hayvan modeli olarak kullanılır. Uzamsal görüntüleme için larva zebra balıklarını verimli bir şekilde kriyoseksiyon yapmak zordur. Doku yapısını ve saptanabilir genleri korumak için kesitler yüksek kalitede olmalıdır (Şekil 4). Mekansal olarak verimli görüntüleme için birden fazla numune ...

Tartışmalar

Bu rapor, geliştirme sırasında mekansal transkriptomik analizde model organizma olarak zebra balığı ile ilgili teknik zorlukların çoğuna ayrıntılı çözümler sunmaktadır. Bu zorlukların üstesinden gelirken, kompakt numune düzenlememiz, ortaya çıkan mekansal transkriptomik platformlardaki maliyetleri optimize eder¹. Uzamsal görüntüleme için larva zebra balığının kriyoseksiyonu zordur. Bölümler, tatmin edici deneysel yürütme ve aşağ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide