이 문서는 제리에 NIH의 부여에 의해 투자되었다. 나는 기록 데모 중 하나를 사용 cholinergic 모터 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현 형질 벌레를 제공하는 닥터 알렉스 고츠쵸크 감사하고 싶습니다.

해부에 사용되는 도구 A. 준비. <ol><li> 해부 / 녹음 챔버 : 우리가 일반적으로 22mm 직경 원형 덮개 유리를 수용할 수있을만큼 충분히 큰 것을 중심으로 몰락 원형 구멍, 1 / 16 일 인치 자석 시트 밖으로 우리의 기록 챔버를 구성. 챔버의 외부 크기는 레코딩을 할하는 데 사용되는 현미경 무대에 따라 달라집니다. 자성 시트의 뒷면에, 우리는 커버의 각 모서리에 낮게 녹아 Paraplax 조직 삽입 왁스의 펠렛을 배치하여 챔버를 준수 48 X 60mm 커버 슬립을 첨부 유리와 챔버 사이에 끼워 넣으면 슬립 . 그것이 지속적인 레이어 gluing 챔버에 커버 슬립을 형성 때까지 왁스 그런 다음, 유리 플레이트가 직면하고, 뜨거운 접시에 녹아있다. 왁스 빨리 녹으로이 단계는 무인 두지 마십시오. 챔버 제거하고 즉시 그 밀랍이 녹아서가로 냉각해야합니다. 22mm 원형 구멍의 안쪽 가장자리를 따라 새어가 초과 왁스는 면도날 에지를 사용하여 제거할 수 있습니다. </li><li> Sylgard - 코팅 커버 풀렸는데 : 해부가 22mm, 녹화 챔버의 원형 캐비티 내에 배치됩니다 Sylgard - 코팅 커버 슬립에 수행됩니다. Sylgard 코팅은 cyanoacrylic 접착제가 다운 또한 웜은가 연결되면 접착제 피펫 팁을 다시 부수하는 쿠션 역할을 할 때 gluing 슬립 커버를 준수하는 데 도움이됩니다. Sylgard가에 따라 신선한 구성되어있는 지침을 (10 부품 실리콘 기지 1 무게로 에이전트를 치료 부분) 제조하고 있습니다. Sylgard의 작은 방울이 다음 각 표지 슬립에 위치하고 심지어 표면을 만들기 위해 면도날 에지를 사용하여 전체 발랐습니다. 코팅 커버 풀렸는데 대형 평면 적용 컨테이너에 배치하고 치료하기 위해 야간 65 ° 학위 오븐에 남아 있습니다. </li><li> Pipettes : 일반적으로, 우리는 전극 풀러를 사용하여 근육의 표피 incisions과 녹음을하고, 아래 gluing의 벌레에 대한 pipettes를 생성하기 위해 동일한 1mm 외경 필라멘트 borosilicate 유리를 사용합니다. 이 단계는 pipettes 여러 신속한 교환을 요구할 수로 절개를하기 전에 pipettes의 항아리를 당길 것이 좋습니다입니다. </li><li> 글루 작은 주걱 : 접착제가로드 입을 압력에 의해 접착제의 피펫의 끝에서 적용됩니다. gluing의 피펫은 피펫 유리 (보통 1mm)의 외경과 일치하는 내부 직경 폴리에틸렌 관의 2 피트 조각의 한쪽 끝을 삽입됩니다. 관의 다른 쪽 끝을는 마우스 피스와 같은 역할을 eppendorf 피펫 팁을 보유하고 있습니다. </li><li> 추출 피펫 : 표피 절개가되었습니다되면 웜 내장이 웜 캐비티에서 제거되어야합니다. 이것은 접착제의 작은 주걱과 비슷한 eppendorf 피펫 팁에 연결된하지만이 경우에 유리 추출 피펫 팁이 계란과 내장 벌레를 구멍 밖으로 진공 청소기로 청소를 쉽게 할 수 있도록 충분히 다시 고장 튜브의 조각으로 이루어진다. </li></ol> B. 해부 <ol><li> 레코딩 챔버에서는 원형 왁스 펜 라인 Sylgard - 코팅 커버 슬립이 자리에 단단히 누를 수있는 챔버 (Sylgard - 코팅이 위쪽을 향하게)의 경계에 가까운 그린 것입니다. 이 왁스 라인 커버 슬립을 움직이게 이하 들어와서 및 해부 및 녹화 중에 커버 슬립을 dislodging에서 녹화 솔루션을 방지할 수 있습니다. 챔버는 다음 세포외 기록 솔루션으로 가득 여러 벌레는 벌레의 선택을 사용하여 중앙에 배치됩니다. 웜은 솔루션에서 수영을 것입니다 그러나 연습이 벌레는 그러한 움직임을 방지하기 위해 냉각으로 더 이상 절차없이 아래 붙은 수 있습니다. 훈련 단계 동안, 그것은 수영이 장애되는 gluing 돌연변이 웜 (예 : UNC - 31 돌연변이 등) 연습을하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 왁스 또는 모델링 점토에서 개최 PCR 모자의 유행 접착제 컨테이너는, cyanoacrylic 접착제의 작업 주식을 보유하는 데 사용됩니다. 기록 pipettes와 비슷한 팁 크기와 글루 pipettes은 (보통 ~ 4 megohms 저항) 접착제를 적용하는 데 사용됩니다. 접착제의 작은 주걱을 사용하여 접착제의 작은 금액은 접착제가 빨아으로 피펫 팁을 시각화하기 위해 절개 범위를 사용하여 접착제의 피펫으로 빨아. </li><li> cyanoacrylic 접착제 (HistoacrylBlue, Aesulap)는 세포외 녹화 솔루션과의 접촉에 polymerizes, 따라서 그것 경화에서 접착제를 방지하고 피펫을 연결해하기 위해 챔버 솔루션을 입력으로 아교 피펫에 대한 긍정적인 압력을 유지하는 것이 중요합니다. 즉시 아교 피펫은 챔버 솔루션이므로, 접착제의 작지만 일정한 스트림 도전 막기 위해 입에 압력 제어 아래 Sylgard 표면에 적용해야합니다. 피펫가되면 그것이 때로는 부드럽게 sylgard - 코팅 유리에 팁을 감청에 의해 차단 수 연결. 그것은 당신이 아교 벌레하기 전에 gluing 연습을하는 것이 좋습니다. 당신이 정기적으로 벌레 너비보다 얇은 라인 만들어진 문자와 Sylgard에 접착제에 자신의 이름을 쓸 수있다면 당신은 PROC 준비gluing 웜 표피를 eed. </li><li> 접착제 벌레를, 머리 또는 웜의 꼬리 하나에 접착제의 작은 금액을 연결하는 긍정적인 압력을 사용하여 빠르게 Sylgard 표면에 벌레를 그립니다. 벌레가 너무 가장자리 근처 녹음 pipettes로 도달하기 어려울 것입니다 접착으로 챔버의 중앙 근처에 웜을 첨부하여보십시오. 다음 (복부 근육 레코딩의 경우) 안쪽을 향하게 외음부와 C - 위치로 벌레를 강제, 시작 첨부 파일에서 웜의 표피의 지느러미 가장자리 접착제의 지속적인 흐름을 적용할 수 있습니다. 이 접착제 라인의 모든 간격은 웜이이 적극 표피 절개 단계 동안 분리에서 벌레를 방지하기 위해, 첨부 너무에 기입되어야합니다. </li><li> 표피 절개하려면, 휴대용 절개의 피펫로 전환합니다. 이 피펫은 접착제 / 레코딩 pipettes보다 선명하고 짧은 튼튼한 샤프트를해야합니다. 해부 범위에서 가장 높은 배율을 사용하여 웜의 세로축에 피펫의 병렬 정렬과 표피 / 접착제 인터페이스에서 절개를하는 웜 (가까운 음문)를 따라 미드에 대한 제보를 삽입합니다. 이것은 절개는 절개 지점을 통해 계란과 창자를 강제 벌레의 수압을 출시. 당신이 인두에 도달할 때까지 편지를 열고 비슷한 깔끔히 모션으로 웜의 머리쪽으로 표피를 절단 계속합니다. 벌레의 내부 장기를 진공으로 추출 피펫으로 전환합니다. 절개를 비운 후, 열린 표피가의 원통형 모양을 유지합니다. Sylgard 표면에 표피의 상처 가장자리를 용접 현장에 신선한 gluing의 피펫을 사용합니다. NMJs를 손상 또는 왜곡되지 않도록이 단계에서 최소한의 접착제 장소를 사용하는 것이 중요합니다. 복부 신경 코드 및 바디 벽 근육 이제 노출됩니다. </li><li> , NMJs을 커버 지하 막을 제거 챔버에서 세포 녹화 솔루션을 빨아하고 10-20 초 정도 collagenase를 (세포 레코딩 솔루션 0.4mg/ml)을 적용하려면, 제거하고 신선한 세포 녹음 솔루션 여러 번 씻는다. 녹음 단계로 진행합니다. </li></ol> C. 패치 - 클램프 녹음 <ol><li> 센터 벌레를 위해 10X 목표를 사용하여 최대 오른쪽 현미경 무대에서 녹화 챔버를 놓습니다. DIC와 40X 물 출현 목표로 전환하고 본문 벽의 근육과 신경 코드가 손상되었는지 확인하십시오. 벌레의 세로축은 전극이 모두 왼쪽과 오른쪽 측면에서 도입 수 있도록, 범위의 전면 가장자리와 평행하게되도록 벌레를 놓습니다. </li><li> 표준 패치 - 클램핑 기술을 사용하여 근육을 패치. 약 4 megohms 저항의 기록 전극은 잘 작동합니다. 전극은 근육 막에 접촉되면 gigohm의 밀봉을 얻을 때까지, 부정적인 압력을 증가. 전체 셀 전압 클램프 녹화 모드에 대한 자세한 흡입을 적용하고 gigohm의 인감이 터진 때까지 멤브레인 보내겠. 좋은 녹음에 야생 형 성인 벌레의 시체를 벽의 근육은 일반적으로 ~ 70 PF의 셀 멤브레인 용량을 가지고 있고 안정적​​으로 최소한의 유지 전류 (~ 50 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 적어도 10 분 동안 기록할 수 PA). </li><li> NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4, 포도당 10, 자당 5, HEPES 15 일 (산도 7.3 ~ 330mOsm) : 세포 녹화 솔루션 (MM)을 구성되어 있습니다. 패치 피펫은 (MM)를 포함 KCl 120 코 20, MgCl 2 4 (N - 트리스 [히드록시 메틸] mthyl - 2 - aminoethane - 술폰산) TES 5, 이수화물 CaCl 2 0.25, 나이 ATP 4 자당 36 , EGTA 5 (산도 7.2 ~ 312 mOsm). 참고 :이 솔루션은 인공적으로 GABA 수용체 - 매개 전류가 안쪽 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 염화물 유출로 인해되도록, 염화물과 함께 근육 세포를로드합니다. 이러한 솔루션에 대한 유사 (자세한 내용은 간행물을 참조) 사용되었습니다. </li><li> 릴리스를 Evoked. 일반적으로 우리는 패치 근육으로 복부 신경 코드 앞쪽에에서 세포외 솔루션을 포함하는 두 번째 전극을 배치. 이 느슨한 패치 구성 야생 타입 웜에서 최대한의 evoked 응답 (일반적으로 2.0-2.5 NA)를 달성하기 위해 짧은 기간 동안 많은 depolarizing 자극 (볼트의 10 초의 순서에) (1 - 2ms)이 필요합니다. 이 방법의 한계는 다음과 같습니다 1) 신경 코드가 irreversibly 손상이되기 전에 단지 몇 evoked 반응이 알 수없는 이유로) 전달할 수 있습니다, 단 cholinergic evoked 반응이 자극의 구성을 사용 elicited 수 있습니다. </li><li> 라이트 채널 rhodopsin의 자극을 활성화. 최근 고츠쵸크 연구소는 표현 조류 파생 표현 4 운전하는 데 사용되는 발기인에 따라 뉴런의 일부에 가벼운 자극시 막을 depolarize 채널 rhodopsins합니다.을 유전자 변형 벌레가 발생 C.의 경우 엘레간스 NMJ 역시 cholinergic 모터 뉴런 또는 GABAergic 모터 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현하는 통합 노선 지금 availabl 아르E. 채널 rhodopsin은 모든 트랜스 망막이 옵신 잔기와 관련된 경우 조명에 대응 때문에,이 응용 프로그램에 사용되는 웜은 망막과 같이 엮여 박테리아에 성장해야합니다. 녹색 광 펄스는 다음 반복 유전자 변형 웜을 사용하는에 따라, ACH 또는 GABA 중 하나 evoked 출시를 일으키는 채널 rhodopsin을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 유전자 변형 벌레는 돌연변이 변종 넘어들어왔잖소 수 있습니다. 이전 전기 자극을 통해이 기법의 장점은 다음과 같습니다, 1) 라이트 - 활성화 GABAergic 또는 cholinergic 운동 뉴런이 독립적으로 공부를 할 수있는 하나의 자료를 Evoked) 많은 반복 stimulations 수행 2 수 있도록,의 연결을 손상을 발생하지 않습니다. </li><li> Hyperosmotic 유발 놓습니다. 쉽게 - releasable 소포 수영장 (모든 NMJ의 기록 근육에에서 준비하는 vesicles의 표현 수영장을 반영)하는 데 사용됩니다 hyperosmotic 세포 솔루션 (추가 자당을 추가하여 ~ 850 mOsm 조정)이있는 압력 피펫의 크기를 측정합니다. 1-3초의 압력 - 펄스 응용 프로그램은 위에서 설명한 표준 솔루션을 사용하여 비동기 포스트 시냅스 이벤트 공세를 생성합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> 그림 1 : C.의 도식 개요 엘레간스 해부 및 신경근육학 녹음 구성 유리와 치료에 걸쳐 Sylgard의 번짐 한 방울에 의해 sylgard 코팅 coverslip는 밤새 조립식 녹음 챔버의 원형 구멍에 위치하고 녹음 솔루션으로 덮여 있습니다. 중앙에 배치 웜은, 머리 또는 꼬리부터 웜 등의 측면에 접착제를 적용, 아교 피펫을 사용하여 Sylgard 표면에 붙어있다. 일단 gluing는 표피와 접착제 사이의 인터페이스에서 유리 바늘로 만든이고 머리 (레드 천공 라인 참조)쪽으로 확장, 외음부에 인접 절개 완료됩니다. 내장과 뱃속에서 알을 추출 다음, 절개의 상처 가장자리가 자리 - 용접 복부 신경 (녹색) 및 신체 벽 근육 (적색)을 노출 Sylgard에 접착제로. 외음부에 앞쪽에 복부 - 중간 근육 패치 - 고정되어과 자극 전극이 신경 코드에 상류 위치입니다. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Represenative 그림" width="600" height="404" /> 전체 셀, 전압 - 고정되어 신체 벽 근육 레코딩은 (전기 evoked, 빛을 evoked 및 hyperosmotic 답변) 위에서 설명한 세 가지 자극 프로토콜 각각에 대해 표시됩니다. 모든 경우에 복부 - 중간 바디 벽 근육이 -60 뮤직 비디오에 고정되어 있습니다. A. 야생 형 근육 세포는 일반적으로 표준 레코딩 솔루션에 내생 안쪽 미니어처 시냅스 전류의 높은 속도를 나타냅니다. B.는 앞쪽에 복부 신경 코드의 2ms 탈분극 야생 타입 웜의 2-2.5 주변 NA의 큰 evoked 대한 응답으로 발생하는 여러 시냅스에서 동기 릴리스됩니다. A와 B의 야생 타입 흔적의 오른쪽에있는 대표적인 성분은 심각한 uncoordinated 돌연변이 (UNC - 18)에서 시냅스 릴리스를 보여줍니다. 패널 C는 cholinergic 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현 야생 타입 웜 신경근육학 교차점에서 빛을 evoked 응답을 보여줍니다. 2ms 빛의 펄스는 일반적으로 1.5-1.8 NA의 응답을 생산하고 있습니다. D. 1S에 대한 근육에 850 mOsm hyperosmotic 호수의 압력 방출은 vesicles의 쉽게 - releasable 수영장을 나타내는 미니어처 시냅스 전류의 비동기 공세를 생성합니다.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li><li>Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. 1, (2006).</li><li>Liewald, J. F., Brauner, M., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature methods. 5 (10), 895-895 (2008).</li><li>Lockery, S. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 293, 201-201 (1998).</li><li>Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 617-617 (2001).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (9), 791-791 (1999).</li></ol>

유전자 모델 생물 C, 엘레간스은 이상적으로 시냅스 단백질을 인코딩 유전자에 돌연변이의 기능 분석을 통해, 시냅스 전달의 연구에 가장 적합합니다. 여기서 우리는 C를 렌더링 절개 기법을 설명했습니다 엘레간스는 electrophysiological 분석을위한 접근 NMJs. 함께 비디오 C.에서 중요한 단계를 모습 엘레간스 해부와 시냅스 활동을 측정하는 데 사용되는 일반적인 레?...

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotransmission는 뉴런이 빠른 시간 척도에 그들의 포스트 시냅스 목표로 화학 신호를 통해 정보를 전송하는 과정입니다. 이 복잡​​한 과정은 적절한 시냅스 연결, 전기 신호의 전도, 타겟팅 및 분비의 vesicles, 칼슘 감지, 소포의 융합, 현지화 및 postsynaptic 수용체의 기능 마중물을 보장하기 위해 많은 사전 및 사후 시냅스 단백질의 조정 활동이 필요하고 마지막으로, 재활용 메커니즘. neuroscientists로서 그것은 다음과 같이 각 기능을하는 단백질 명료하게하다와 행동 그들의 메커니즘을 이해하는 우리의 목표입니다. 시냅스에서 Electrophysiological 녹음 시냅스 전송 중에 발생하는 근본적인 전기 사건의 밖으로 읽기 같지는를 제공합니다. 분자와 유전 도구의 강력한 배열과 C로 시냅스 단백질을 조작 가능한이 기술을 결합하여 엘레간스, 우리는 시냅스 전달의 결과 기능 변화를 분석할 수 있습니다. C. 엘레간스는 모터 신경 및 신체 벽 근육 제어 운동이 시냅스 1 따라서, uncoordinated locomotory phenotypes UNC (S라고도 함)와 돌연변이가 자주 교란 시냅스 전송 사이에 형성 NMJs. UNC의 돌연변이 세균 음식 소스의 풍부한 공급 유지되기 때문에, 그들은 음식을 알아보는 몇 가지 pharyngeal 펌핑 능력을 보유만큼 가능한 남아 있습니다. 이 같이 사실과 그 C. 엘레간스가 나온것과 같은 존재, 그들은 정교한 짝짓기 행동에 대한 필요없이 돌연변이 자손에 전달할 수 있습니다. 이러한 특성은 NMJs 2,3,7 정확히 어떻게 UNC 돌연변이의 영향 neurotransmission 주소로하는이 훌륭한 모델 유기체를 만드는 벌레에서 기록하기 위해 최근 기능과 결합. 절개 방법은 NMJs를 노출 웜 표피에 절개를하기 위해 cyanoacrylic 접착제를 사용하여 immobilizing 성인 웜을 포함됩니다. C. 이후 엘레간스 성인은 절개가 해부 현미경의 사용과 수행 및 뛰어난 판단력을 필요로합니다 길이에서만 1mm입니다. NMJ 레코딩은 전체 세포 개별 바디 벽 근육 세포 및 신경 전달 물질 자료를 클램핑 전압 전기 자극 광 - 활성화된 채널 rhodopsin - 중재 탈분극 4 될 모든 중 hyperosmotic 호수를 포함하여 자극 프로토콜의 다양한 사용 evoked 수에 의해 만들어진 간단히 설명했다.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을 설명합니다<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스 (C. 엘레간스)</em&gt; 그리고 잠시이 준비가 적용할 수있는 수있는 사용의 일부를 설명합니다.

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K 조회수.  University of Illinois, Chicago. 접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을 설명합니다 Caenorhabditis 엘레간스 (C. 엘레간스) 그리고 잠시이 준비가 적용할 수있는 수있는 사용의 일부를 설명합니다.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...