Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (número de subvención MOP 38040) a R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) a R.K., Families of SMA a R.K. y L.M.M, The SMA Trust a T.H.G., y The Muscular Dystrophy Campaign a T.H.G.. L.M.M es un receptor de una beca postdoctoral de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá, y R.K. es un receptor de una cátedra de investigación de salud de la Universidad de Ottawa.

Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con los estándares de cuidado animal establecidos por la institución.
1. Disección de la musculatura abdominal del ratón
<ol><li>Antes de comenzar, enste y enste un 4% de paraformadehído (PFA). Precaución: Mantenga siempre el PFA dentro de una campana extractora de humos y use el equipo de protección apropiado.</li>
	<li>Eutanasia del ratón por un método aprobado. Nota: El ratón que se muestra en el video fue eutanasiado por sobredosis de CO2 y luxación cervical. Este ratón es un ratón de tipo salvaje de 4 semanas de antigüedad en un fondo híbrido CD1/C57Bl6. Este ratón fue criado en las instalaciones de animales de la Universidad de Ottawa a partir de ratones que fueron comprados originalmente.</li>
	<li>Haga una incisión inicial a través de la piel a nivel de la cadera y corte a través de la piel todo el camino alrededor del ratón.</li>
	<li>Despega la piel, tirando hacia arriba hasta que llegues al nivel de la extremidad anterior.</li>
	<li>Corte a través de la musculatura abdominal a nivel de la cadera y continúe la incisión hasta llegar a la columna vertebral.</li>
	<li>En este punto, comience a cortar hacia arriba a través de la musculatura y las costillas hasta llegar a la extremidad superior.</li>
	<li>Cortar recto a través de hasta llegar a la columna vertebral en el otro lado.</li>
	<li>Corta hacia abajo hasta llegar al punto en el que empezaste.</li>
	<li>Suelte el diafragma de debajo (teniendo cuidado de no dañar el músculo TVA) y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un plato de disección recubierto de SYLGARD con pasadores de disección de 0,2 mm.</li>
	<li>Fije la caja torácica y la musculatura asociada en el plato, de lado superficial hacia arriba, asegurándose de que el músculo esté completamente estirado.</li>
	<li>Vierta el PBS 1x y reemplácelo con un 4% de PFA.</li>
	<li>Cubrir y dejar en una plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Lavar 3x en 1x PBS a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
</ol>* En este punto los músculos fijos se pueden dejar en una nevera durante la noche antes de la posterior disección.
2. Aislamiento del músculo TVA
<ol><li>Para proceder con el aislamiento del músculo TVA, bajo un microscopio de disección, comience cortando a través del músculo oblicuo externo a nivel de las últimas costillas (Ver Figura 1 para una guía anotada).</li>
	<li>Cortar directamente hacia abajo al lado de la linea alba (teniendo cuidado de no cortar a través de la TVA a continuación) hasta llegar al inicio del músculo oblicuo interno.</li>
	<li>Luego corte para liberar los rectos abdominales y los músculos oblicuos externos de la parte superior de la TVA a continuación.</li>
	<li>Retire el vaso sanguíneo y cualquier grasa sobreabordante del músculo TVA.</li>
	<li>Suelte el músculo de la última costilla que lo sobrea relanza.</li>
	<li>Cortar alrededor de los márgenes del músculo y retirar a una placa de 24 pozos que contiene PBS.</li>
</ol>3. Etiquetado inmunofluorescente y microscopía del músculo TVA
Para todos los pasos posteriores, retire el líquido con una pipeta de punta fina y deje la placa en una plataforma oscilante. A menos que se indique lo contrario, todos los pasos posteriores se realizan a temperatura ambiente.
<ol><li>Incubar en PBS que contenga 1:1,000 bungarotoxina marcada fluorescentemente durante 30 min para etiquetar a los NMJ. Esto se puede hacer en una habitación oscura o bajo papel de aluminio.</li>
	<li>Permeabilizar el músculo añadiendo 300 μl por pozo de 2% Triton X-100 en PBS y dejar en una plataforma oscilante durante 30 min.</li>
	<li>Incubar en reactivo de bloqueo (4% BSA, 1% Tritón en PBS) durante 30 min.</li>
	<li>Incubar en reactivos de bloqueo que contengan anticuerpos primarios (neurofilamento 1:100; proteína de vesícula sináptica 2, 1:250) a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Lavar 3x en 1x PBS.</li>
	<li>Incubar en PBS que contiene anticuerpo secundario 1:250 durante 2-4 horas.</li>
	<li>Lavar 3x en 1x PBS.</li>
	<li>Monte los músculos en diapositivas de vidrio usando suficientes medios de montaje fluorescentes y cubrebocas.</li>
	<li>Los portaobjetos se ven mejor utilizando un filtro de paso de doble banda en un microscopio epifluorescente estándar.</li>
	<li>Los NMJ se representan mejor utilizando una proyección de la serie z en un microscopio confocal equipado con al menos un objetivo de 40X.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este video, hemos detallado un protocolo para la disección del músculo TVA del ratón y para el etiquetado inmunofluorescente de montaje completo de NMJ dentro del músculo. También presentamos datos que muestran que este músculo se puede utilizar para analizar la patología de la unión neuromuscular en un modelo de ratón de SMA.
El éxito en esta técnica depende de una serie de factores. Algunos de los problemas más comunes se describen a continuación. En primer lugar: mala tinción inmunohistoquímica. Puede haber una serie de razones para esto, una de las más comunes es el uso de reactivos diferentes a los enumerados en este protocolo. Un PFA de grado de microscopía electrónica de alta calidad es muy importante para asegurar una buena tinción, al igual que la elección de los anticuerpos enumerados en este protocolo. Además, en animales mayores(es decir,> 3 meses), obtener tinciones de buena calidad puede ser más difícil. Esto se debe al aumento del grosor de la fascia que rodea el músculo y el aumento de la acumulación de grasa entre el oblicuo externo y el tranversus abdominis. Es importante quitar la grasa, antes de proceder a la inmunofluorescencia. También puede ser necesario quitar parte de la fascia que cubre el músculo, que puede engrosarse. A veces es difícil quitar la fascia y la grasa del músculo sin incurrir en algún daño a la fibra muscular y una interrupción en el patrón de inervación. Sin embargo, si esta técnica se realiza con cuidado, se pueden adquirir tinciones de buena calidad de ratones hasta por lo menos 1 año de edad. En ratones más jóvenes(es decir,menores de 3 meses de edad) no debería ser necesario realizar ninguna burla o separación de fibras musculares. En segundo lugar: difícilmente en encontrar NMJs después de la disección y de la coloración. Esto es a menudo porque la disección no se ha extendido por debajo de la última costilla. La mayoría de los NMJ se encuentran justo debajo de la última costilla y, por lo tanto, se debe tener cuidado para garantizar que esta parte del músculo se incluya en la disección. En tercer lugar: adherencia del músculo EO al músculo TVA. Esto es a menudo una queja cuando los individuos intentan extender la disección debajo del nivel del músculo oblicuo interno (IO). El área del músculo TVA donde el IO también está presente es más difícil de analizar, ya que puede ser difícil distinguir qué músculo es cuál. Por esta razón, rutinariamente sólo diseccionamos la parte más superior del músculo TVA. En este nivel, no hay adherencia entre los músculos de la OE y la TVA, y por lo tanto esto no debería ser un problema significativo.
Un obstáculo significativo al uso del músculo TVA, comparado a los músculos apendiculares, es accesibilidad para las manipulaciones quirúrgicas o la inyección de sustancias. Estos tipos de experimentos pueden ser cruciales para investigar la fisiología de NMJ en un músculo dado. Aunque la TVA es ciertamente menos fácilmente accesible que los músculos más comúnmente utilizados como tibialis anterior o gastrocnemius,trabajos anteriores han demostrado que es posible denervar la TVA por lesión quirúrgica de los nervios intercostales18. Recientemente también hemos utilizado este músculo para la administración local de sustancias bajo anestesia general (datos inéditos). Aunque estos experimentos pueden representar un desafío técnico moderado, este trabajo muestra que son factibles y por lo tanto extienden la utilidad de este músculo para el análisis de NMJ bajo manipulación patológica y fisiológica.
El músculo TVA es uno de una serie de músculos planos delgados situados en todo el cuerpo que se pueden utilizar para el análisis de montaje completo de los patrones de inervación. Otros músculos incluyen un grupo de músculos craneales inervados por las neuronas motoras que se originan en el núcleo facial del tronco encefálico, abarcando el elevador auris longus, auricularis superior,y el aductor auris longus,las disecciones para las que se han descritoanteriormente 14,19. Además, la musculatura que rodea el músculo TVA, incluyendo EO, IO, y abdominis del músculo recto,se puede también etiquetar y utilizar para el análisis de NMJ. Para un análisis exhaustivo de la patología NMJ en un modelo de ratón, es importante considerar una serie de músculos situados en todo el cuerpo y no restringir el análisis a un solo músculo. Esto se ejemplifica en modelos murales de enfermedades de la neurona motora donde existe una heterogeneidad significativa en los niveles de patología NMJ entre diferentes músculos20. Tal variabilidad intermuscular es una herramienta extremadamente valiosa al investigar el mecanismo de la vulnerabilidad de la neurona motora y, por lo tanto, restringir el análisis a un solo músculo podría disminuir significativamente el potencial de la investigación.

Las uniones neuromusculares (NMJ) son la conexión sináptica entre una neurona motora inferior y una fibra muscular esquelética. Tradicionalmente se consideran una sinapsis tripartita, compuesta por una neurona (terminal presináptica), fibra muscular (terminal post sináptica) y célula terminal de Schwann1. Los NMJ parecen ser dianas tempranas y significativas en patología en una serie de enfermedades de la neurona motora y modelos de ratón2,3. Los síntomas típicos incluyen la denervación, donde el endplate del motor llega a ser desprovisto de una inervación presináptica, hinchazón del terminal presináptico, y una reducción en la complejidad de la morfología de NMJ4-11. También se pueden observar respuestas compensatorias, que incluyen brotación terminal y nodal, donde los procesos axonales se extienden desde terminales o entrenudos sinápticos restantes hasta placas finales denervadas reinnervadas12,13. Debido a la estrecha correlación entre la actividad sináptica y la morfología nmj, una gran cantidad de información se puede obtener sobre el estado funcional de las neuronas motoras a partir del análisis de la morfología NMJ. Como la pérdida de NMJ frecuentemente representa uno de los primeros aspectos de la patología neuromuscular4,10,la cuantificación a nivel de inervación puede dar información importante sobre la progresión de la patología y el efecto potencial de una intervención terapéutica. Además, pues la pérdida de NMJ representa un paso significativo en la progresión patológica, el desarrollo de la terapéutica que puede estabilizar conexiones y animar la regeneración puede rendir la ventaja significativa.
Al analizar la morfología de NMJ, la elección muscular es de gran importancia. Algunas de las consideraciones principales podrían incluir el tipo de fibra muscular, posición del cuerpo, y el análisis comparativo de las condiciones humanas. Además, cuando se requieren manipulaciones como la inyección de sustancias o lesiones traumáticas del nervio, la accesibilidad experimental también es importante considerar. En general, es preferible analizar una gama de músculos posicionados en todo el cuerpo que reflejan una gama de subtipos de unidades motoras. A menudo, sin embargo, la elección muscular está influenciada por la facilidad de disección. Por lo tanto, el análisis de NMJ se realiza a menudo exclusivamente en los músculos apendiculares grandes tales como gastrocnemius. Para obtener una buena tinción nmj en tales músculos, a menudo se requiere seccionamiento o interrupción mecánica de las fibras musculares. Como resultado, el patrón de inervación puede verse interrumpido y un análisis exhaustivo y de alta calidad de los patrones de inervación, brotación y denervación a menudo se ve comprometido. Un enfoque alternativo es utilizar músculos planos delgados que no requieren seccionamiento y pueden ser teñidos y montados intactos, lo que permite una visión general completa de toda la inervación del músculo. Hay una serie de músculos que se pueden utilizar para tal análisis, incluyendo un grupo de músculos craneales, (que abarca el elevador auris longus, auricularis superior, y aductor auris longus)14, músculos torácicos(por ejemplo. triangularis sterni) 15, y músculosabdominales (por ejemplo, transversus abdominis (TVA)). El principal obstáculo en el uso de tales músculos es la experiencia técnica necesaria para diseccionarlos sin daño.
En este video, proporcionamos un protocolo para diseccionar y realizar el etiquetado inmunofluorescente del músculo TVA del ratón para permitir un análisis exhaustivo del patrón de inervación y la morfología NMJ. El músculo TVA es un músculo predominantemente lento de la contracción nerviosa que comprende la capa más profunda de musculatura abdominal y es inervado por los nervios intercostales más bajos. Trabajos anteriores han demostrado que es consistentemente altamente vulnerable a la patología en una serie de modelos de ratón de la enfermedad de la neurona motora infantil atrofia muscular espinal (AME) y en otros modelos de ratón de la degeneración de la neurona motora de inicio temprano4,16. Por lo tanto sugerimos que el TVA sea un músculo útil para emprender análisis de NMJ en neuropathies periféricos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

El análisis de la morfología neuromuscular de la ensambladura puede dar la penetración importante en la situación fisiológica de una neurona de motor dada. El análisis de los músculos planos delgados puede ofrecer una ventaja significativa sobre los músculos más gruesos utilizados tradicionalmente, como los de la extremidad posterior(por ejemplo. gastrocnemius). Los músculos delgados permiten una visión general completa de todo el patrón de inervación para un músculo dado, que a su vez permite la identificación de piscinas selectivamente vulnerables de neuronas motoras. Estos músculos también permiten el análisis de parámetros como el tamaño de la unidad motora, la ramificación axonal y la brotación terminal/nodal. Un obstáculo común en el uso de tales músculos es ganar la experiencia técnica para diseccionarlos. En este vídeo, detallamos el protocolo para diseccionar el músculo transverso abdominal (TVA) de ratones jóvenes y realizar inmunofluorescencia para visualizar axones y uniones neuromusculares (NMJ). Demostramos que esta técnica da una descripción completa del patrón de la inervación del músculo de TVA y se puede utilizar para investigar la patología de NMJ en un modelo del ratón de la enfermedad de la neurona de motor de la niñez, atrofia muscular espinal.

El protocolo antedicho dirige el aislamiento y la coloración del músculo de TVA para el análisis de NMJ. Esto permite el análisis de montaje completo de los patrones de inervación muscular, así como el análisis de alta resolución de la morfología NMJ (Figura 2). Esta técnica se puede aplicar con éxito para revelar la patología NMJ en modelos de ratón de la enfermedad de la neurona motora, como SMA4,17(Figura 3). En modelos del ratón de SMA hay variabilidad intramuscular significativa en patología, no obstante el músculo de TVA es constantemente altamente afectado. Esto se evidencia por la denervación de las placas terminales motoras, la acumulación de neurofilamentos en el terminal presináptico y la brotación terminal (Figura 3). Los resultados presentados aquí demuestran así que la técnica descrita arriba puede ser un método de gran alcance para proporcionar una descripción comprensiva de la inervación y del análisis de la patología de NMJ en modelos del ratón.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Descripción general de la musculatura abdominal del ratón. (A)La imagen muestra la jaula torácica con musculatura abdominal adherida, que ha sido extraída de un ratón recientemente eutanásico y fijada en un plato de disección superficial lateral hacia arriba(A). (B)La disección en A ha sido anotada para marcar los límites aproximados de los músculos abdominales. Los músculos abdominales superficiales se pueden ver en el lado izquierdo de la disección, e incluyen oblicuo externo (delineado en azul) y recto abdominal (delineado en rojo). En el lado derecho de la disección, los músculos superficiales se han eliminado permitiendo la visualización del músculo transverso abdominal (delineado en verde) y el músculo oblicuo interno (delineado en amarillo). El objetivo de este protocolo es dirigir la disección de la parte superior del músculo TVA, mostrado aquí como triángulo verde sólido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. Descripción del Entero-montaje de ensambladuras neuromusculares en músculo de TVA. Imágenes que muestran ejemplos de NMJ del músculo TVA visualizados con tinción inmunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) y bungarotoxina (BTX; rojo). Las imágenes son micrografías fluorescentes montadas que muestran todo el músculo(A)o imágenes confocales que muestran grupos(B)o individuales(C)NMJ. Barra de escala = 800 μm(A), 70 μm(B), 25 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Figura 3. Patología neuromuscular de la ensambladura en músculo de TVA de un modelo del ratón de SMA. Micrografías confocales que muestran NMJ del músculo TVA visualizado con tinción inmunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) y bungarotoxina (BTX; rojo) de control(Smn2B/+) o modelo de ratón SMA(Smn2B/-). Tenga en cuenta que mientras que la morfología normal de NMJ se puede observar en ratones de control, en los músculos tva de smn2B / - ratones hay evidencia de denervación completa (punta de flecha blanca), denervación parcial (punta de flecha púrpura) brotación terminal (punta de flecha azul) e hinchazón presináptica (punta de flecha amarilla). Las placas finales post-sinápticas también son menos complejas reflejando un fenotipo aparentemente menos maduro. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a>.

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

En este vídeo demostramos un protocolo para la disección del músculo transverso abdominal del ratón y utilizamos inmunofluorescencia y microscopía para visualizar las uniones neuromusculares.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.4K vistas.  Ottawa Hospital Research Institute. En este vídeo demostramos un protocolo para la disección del músculo transverso abdominal del ratón y utilizamos inmunofluorescencia y microscopía para visualizar las uniones neuromusculares.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...