Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Departamento de Defensa (BC075554 a BG y BC061403 a DK), EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (U54GM064346 a JvR; CA100324 a JC, JES y JW, CA77522 a JES, U54CA126511 a JC y BG). Damos las gracias a D. Entenberg para ayudar con el microscopio, M. Rottenkolber para ayudar en la fabricación de la caja de imagen y J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) para el anticuerpo F4/80.

1. Generación de tumores fluorescente mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria: <ol><li> Cultivar una línea celular que expresa Dendra2 proteínas (como un marcador citoplasmático) a 40 - 80% de confluencia. </li><li> Enjuague los platos por lo menos 3 veces con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina por plato de 10 cm y se incuba a 37 ° C hasta que la mayoría de las células de separar y volver a golpear el plato sobre una superficie plana para que temblar. </li><li> Enjuague todas las células de la placa, y el uso de un raspador (goma de policía) para recoger la matriz también. Agregar los 5 ml de PBS. Tomar una alícuota de contar durante el centrifugado. </li><li> Centrifugar a 800 g por 5 min. </li><li> Aspirar y volver a suspender en PBS a una concentración de 5 - 10 x 10 6 / ml. Almacenar en el congelador hasta inyectado (inyección a los 30 minutos). </li><li> Coloque una jaula que contiene 4-5 semanas de edad ratones inmunodeficientes (SCID, por ejemplo) dentro de una campana estéril. </li><li> Rocíe el área alrededor de la cuarta (abdominal) pezón con etanol al 70%. </li><li> Inyectar 0,1 ml en la almohadilla de grasa mamaria. Si un asistente se puede encontrar, una persona puede ocupar el ratón en su lugar mientras se inserta otra aguja dentro de la almohadilla de grasa mamaria. Si se inyecta usted mismo, ponga el ratón bajo anestesia ligera con isoflurano. </li><li> Una vez que el tumor ha crecido a 5.7 mm, la ventana de imagen Mamaria (MIW) debe ser insertado. Nota: Como alternativa, para algunas aplicaciones, la MIW pueden ser insertados en la parte superior de la almohadilla de grasa mamaria sana y las células se pueden inyectar después. Este enfoque permite que imágenes de las células transfectadas transitoriamente en un entorno fisiológico. </li></ol> 2. Manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW): <ol><li> MIWs (Figura 1) son de plástico tejido de grado para garantizar la biocompatibilidad. Para la construcción manual, usamos cinco o platos de 10 cm. </li><li> Poner los guantes de látex en. </li><li> Calentar un plato de cultivo de tejidos y creando una superficie curva, empujando un objeto redondo, duro contra el plato caliente (usamos un poco de 1 pulgada dremmel para esto). </li><li> Cortar el centro del plato con una hoja de afeitar caliente. </li><li> Use una pequeña, en forma de cono poco dremmel para hacer un agujero en el centro de la cúpula en forma de base de plástico (6-7mm de diámetro). </li><li> Hacer que los bordes de la base de plástico completamente lisa por el lijado con la dremmel y continuar con su presentación. </li><li> Archivo de la parte superior de la base de plástico que hace una superficie plana para el cubreobjetos. El diámetro de la presentada, superficie plana debe ser de 9-10mm. </li><li> Pegue la circular de 8 mm cubreobjetos (número 1) en la superficie plana con el pegamento (adhesivo de cianoacrilato). </li><li> Espere a que el pegamento se seque (15 minutos). </li><li> Use una aguja 26G con calefacción para hacer ocho agujeros de perforación de sutura desde el exterior (donde el vidrio es) en el interior de la base. Los agujeros deben ser distribuidas uniformemente alrededor del cubreobjetos, 0,5-1m m de distancia desde el borde del cubreobjetos. </li><li> Ampliar los orificios con una aguja de sutura 5-0. </li><li> Perforar agujeros en la base de plástico hará que la superficie interna irregular. Con papel de lija, hacen de esta superficie totalmente lisa. </li><li> Cambiar de guantes y un cepillo de pequeñas partículas de plástico de la MIW con un pequeño cepillo. </li><li> Lave el MIW con agua destilada. </li><li> Lave el MIW con etanol al 70%. Usar un Q-tip para limpiar el cristal por lo que es completamente transparente. Si hay manchas de niebla presente en el vapor de pegamento, use cuidadosamente la acetona con un Q-tip. </li><li> Esterilizar el MIW por exposición a rayos UV durante 3 horas a cada lado. </li></ol> Semi-manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW): Para fabricar la base de plástico, que actualmente estamos utilizando silicona moldes de goma creados con hechos a mano MIWs. El molde se compone de dos partes de caucho de silicona que hacer una réplica exacta de la parte delantera y trasera de la original, cuando se llena con resina de poliéster y de inmediato se unieron. La resina de poliéster líquido se mezclan las 9:10 y resulta en una estructura dura cuando está totalmente curado en 48 horas. El plástico es con protección UV y de archivo, sin descomponerse o ser amarillo con el tiempo. Después de la base se cura, 2.8-2.16 pasos se llevan a cabo la misma manera que para MIWs manualmente a medida. 3. La inserción de la MIW: <ol><li> El área alrededor del pezón 4 º debería haber un pequeño (diámetro de 5-7 mm), tumor de varios días / semanas después de la inyección de células tumorales en función del tipo de células (fig. 1B). ¿Cuánto tiempo ha pasado después de la inyección de células que expresan proteínas Dendra2 photoswitchable u otras proteínas fluorescentes depende de la línea celular utilizada. El tumor no se deberá presentar una apariencia necrótica, y debe tener una piel intacta con el pelo en la parte superior del tumor. Los ratones con tumores necróticos debe ser sacrificado. </li><li> Preparar el espacio estéril para la cirugía, establecer un trozo de tela estéril dentro de una campana estéril. Ponga un pedazo de estériles gauze en el medio, y sentar las MIWs pocos instrumentos estériles alrededor de él: que utilizamos pequeñas tijeras estándar, tijeras de primavera, pinzas microdissecting, pinzas microdissecting, porta-agujas. Mantener estériles Q-tips, una botella de etanol al 70% y guantes estériles en la esquina de la campana. </li><li> El ratón es anestesiado en la campana estéril mediante inyección IP de 2,5% avertina (20 l / g) en HBSS, o bien 10 mg / kg de ketamina + 10 mg / g xilazina (en contacto con su Instituto de Atención de Animales para la aprobación y hacer el pedido). Nota: La solución Avertin debe estar preparado dos veces por semana, usando un filtro esterilizado 0,22 micras filtro y se almacena hasta 500 alícuotas a 4 ° C (en la oscuridad). </li><li> Eliminar el vello por el afeitado de la zona por encima del tumor usando una máquina de afeitar de pequeños animales. </li><li> Retire el resto del pelo con el pelo Nair crema del retiro (disponible en cualquier farmacia). Limpie la piel con etanol por inmersión en Q-tips. </li><li> La transferencia de los animales en la gasa estéril y aplique una pomada oftálmica de los ojos para evitar que se sequen y las infecciones. </li><li> Esterilizar la piel con Betadine y limpia con etanol al 70%. </li><li> Transferencia del animal sobre un paño quirúrgico estéril dentro de la campana estéril. </li><li> Tire de la piel inmediatamente medial al pezón con unas pinzas de corte y la incisión de 2 mm ~ en la piel. </li><li> Separar la almohadilla de grasa mamaria subyacente de la piel con unas tijeras y pinzas de disección. La piel y para hueco durante esta etapa de separación a un tamaño que tendrá en cuenta la inserción de la MIW. </li><li> Si por accidente de un buque se ve afectado durante sugery, utilice un recipiente estéril Q-tips para eliminar la sangre que se produce / para detener la hemorragia sea excesiva. </li><li> Inserte el MIW de tal manera que no es la piel en la parte superior de la base de MIW y sutura en su sitio que no se usen hilo absorbible y revertir el corte de la aguja. </li><li> El uso de tejido adhesivo de cianoacrilato o para rellenar los agujeros de sutura y asegurar el MIW a la piel. </li><li> Añadir TMP-SMX combinación de antibióticos: (sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprim 0,12 mg / ml) en la botella de agua para la jaula de 3 días antes y después de la cirugía. </li><li> El animal se mantiene bajo anestesia para 1-4h después de la inyección IP avertina. Dado que la cirugía generalmente lleva alrededor de 45 minutos, es importante para ayudar a los animales se recuperan después: </li><li> Colocar una compresa caliente a mano (37 ° C) (disponible en farmacias) en la parte inferior de la jaula y cúbrala con una gasa. </li><li> Mantener al animal en la parte superior de la almohadilla hasta que se convierte en su estómago y comienza a caminar. </li><li> Si el animal está inconsciente por más de 3 horas, inyecte 0,3 ml de HBSS por vía intraperitoneal para la rehidratación. </li><li> El animal se le permite recuperarse en los próximos 3-4 días antes de la sesión de imágenes primero se lleva a cabo. </li></ol> 4. Estructura de la caja de imagen El cuadro de imagen asegura que el MIW está sentado plano, justo por encima del objetivo del microscopio. También facilita el control de temperatura y flujo de aire constante a través de la anestesia de isoflurano. La caja está fabricada en plexiglás y se pegan entre sí mediante soldadura de plástico. Sean aptas para la platina del microscopio específico y por lo tanto la forma de su parte inferior varía en función del microscopio usado (Figura 2 muestra el esquema de la caja instalados en fase microscopio Leica SP5). Dimensiones de la caja en centímetros son l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2). La parte inferior del cuadro se compone de una placa hueca, 12.7x8.4 cm de tamaño, que cabe dentro de la platina del microscopio Leica SP5, y dos correderas &quot;puertas&quot; de 5,7 x 5,7 cm_each, que forman una abertura circular (d = 2,22 cm ) cuando está cerrado. El MIW se ajusta a esta apertura. La pieza frontal contiene el orificio de entrada para la aplicación de anestesia, mientras que una de las piezas laterales contiene un orificio de salida que conduce al vacío. Tenga en cuenta que el condensador y el soporte de diapositivas deben ser removidos antes de la colocación de cuadro de imagen. 5. Caja de imagen Uso <ol><li> Colocar el animal bajo anestesia con isoflurano y aplicar ungüento oftálmico para los ojos. </li><li> Conecte el tubo de escape isoflurano de la máquina de anestesia al frente de la caja de imagen, en la parte exterior del orificio de entrada (Figura 2B). </li><li> Conecte un segundo tubo en el orificio de salida de la caja de imagen. Este tubo debe ser conectado al filtro de gas y luego al vacío. </li><li> Abra la tapa de la caja y abrir las puertas de la caja y colocar el animal, MIW lado frente a la parte inferior, y el deslizamiento de las puertas en la caja. </li><li> Mantenga la caja y ajustar las puertas abajo para que la base MIW se lleva a cabo y se inmovilizan entre ellos. La base de MIW debe estar en el mismo nivel que las puertas de imágenes caja, mientras que el cubreobjetos MIW debe ser sólo unos pocos milímetros por debajo de este nivel. Asegúrese de que el posicionamiento de la MIW entre la parte inferior las puertas corredizas se asegura de que el cubre (parte de vidrio de la MIW) quede plano, paralelo a la puerta inferior de la caja. Esto asegurará un enfoque apropiado. </li><li> Baje el objetivo de microscopio, para dejar espacio para la colocación de la caja enparte superior de la platina del microscopio. </li><li> Coloque la caja sobre la platina del microscopio, y ajustar el escenario para que el cubreobjetos MIW está por encima del objetivo. </li><li> Enfoque el objetivo y comenzar a imágenes. </li><li> Durante el uso de isoflurano, el animal debe ser supervisada por la inspección visual de la frecuencia respiratoria. Esto se puede hacer visualmente, o mediante el control de la frecuencia de los artefactos de respiración que aparecen durante la exploración de recogida (que puede interferir con la adquisición de datos). El sistema MouseOx la oximetría de pulso (Starr Ciencias de la Vida Corp) ha sido utilizado con éxito. De esta manera los datos pueden ser recogidos de manera continua sin encender las luces en la habitación para comprobar sobre el animal. Nota: Después de cada sesión de imágenes, recuperación de animales debe ser facilitado por envolver una almohadilla de calefacción pequeña gasa o Kimwipes y ponerlo en el animal en la jaula. Nota: Si un objetivo de inmersión se utiliza para la imagen a través de la MIW, el medio de la inmersión (glicerina, agua, aceite) se debe limpiar fuera de la ventana de imagen. El MIW deben ser inspeccionados para detectar posibles grietas u otros daños que pudiera haber ocurrido durante la exploración. Esto es crítico para la recogida de datos durante las sesiones de formación de imágenes múltiples. </li></ol> 6. Photoswitching y la imagen de Dendra2 células marcadas con El procedimiento se describe en el microscopio confocal Leica SP5, la potencia del láser en el plano focal, objetivos y opciones disponibles puede variar cuando se utilizan otros microscopios confocal o imágenes multifotónica establecido, y por lo tanto el protocolo descrito a continuación deben ser utilizadas como una guía para optimizar la prueba en su microscopio. <ol><li> Al observar el tumor a través del ocular (10x) con el filtro verde fluorescente, localizar los principales vasos sanguíneos que están visiblemente fluye y tumbado en el mismo plano focal. </li><li> La posición de uno de los buques en el centro del campo y pasar a la detección de PMT. </li><li> Establezcan sistemas de recogida de imágenes secuenciales para dos canales. Uno de los canales utiliza 488 nm láser de línea (10% de potencia), y recoge la dispersión de la matriz extracelular (480-495nm) y emisiones de la forma verde de Dendra2 (505-540nm). El segundo canal utiliza la línea del láser 543nm (90% de potencia) y recoge las emisiones de la forma roja de Dendra2 (555-600nm). Recoge imágenes en 3D photoswitching pre-. </li><li> Utilice la opción ROI escanear a PHOTOSWITCH una población elegida de las células con la línea de láser de 405 nm (30% de potencia, las exploraciones 20-40). Recoger emisiones de la forma roja de la proteína para controlar el cambio. </li><li> Utilizando la misma rutina secuencial como en 6.3, recoger después de cambiar las imágenes en 3D. </li><li> Si photoswitching más de una región en el tumor, se recomienda para tomar fotografías a través de los oculares con una cámara digital, en los canales verde y rojo (Figura 3A, B). Esto le ayudará en la orientación durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. Nota: Además, los vasos sanguíneos puede ser temporalmente etiquetados con cola-vena de inyección de dextrano fluorescentes (Cascada Azul o Alexa Fluor 647, ambos 10kDa). Unas pocas horas después de la inyección, dextranos dejará los vasos sanguíneos y permanentemente la etiqueta de los macrófagos. </li></ol> Los resultados representativos: La figura 3C muestra una región rectangular photoswitched (rojo) orientados ortogonalmente con respecto a los vasos sanguíneos (no fluorescencia). No photoswitched células son de color verde, mientras que la dispersión de la matriz extracelular es de color púrpura. La imagen es una proyección de intensidad máxima de cuatro imágenes a lo largo del eje Z (20-50 m de profundidad).

<ol>
	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein,+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy,+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis.">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li><li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+gene+expression,+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li><li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling.">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li><li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy.">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

En la última década, la microscopía intravital de los tumores de mama en ratones y ratas en una sola célula de resolución<sup&gt; 4.1</sup&gt; Ha dado lugar a importantes conocimientos sobre los mecanismos de comportamiento metastásico como la migración, invasión y intravasation de las células tumorales<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, La angiogénesis<sup&gt; 3</sup&gt; Y la respuesta de las células inmunes<sup&gt; 9.7</sup&gt;. Recientemente hemos informado de una técnica de imagen de mama carcinomas ortotópico a través de múltiples sesiones de imagen intravital en ratones vivos<sup&gt; 10</sup&gt;. Para ello, hemos desarrollado una ventana de imagen Mamaria (MIW) y los parámetros optimizados de imagen para Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching e imágenes<em&gt; In vivo</em&gt;. Aquí se describe el protocolo para la fabricación de MIW, la inserción de la MIW en la parte superior de un tumor y la imagen de las células tumorales Dendra2 marcado con una caja de encargo construido de imágenes. Este protocolo se puede utilizar para la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en diferentes microambientes en los tumores y permite obtener imágenes a largo plazo de los vasos sanguíneos, las células tumorales y las células huésped.

Watch this Scientific Journal Video about Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window at JoVE.com

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Photoswitching intravital y el seguimiento de Dendra2 marcado con las células tumorales a través de la ventana de imagen mamaria es una técnica que nos permite la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en los microambientes tumor elegido por un plazo de días.

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vistas.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Photoswitching intravital y el seguimiento de Dendra2 marcado con las células tumorales a través de la ventana de imagen mamaria es una técnica que nos permite la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en los microambientes tumor elegido por un plazo de días.

Video: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Investigación

Biología

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Los componentes principales del microscopio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagen funcional de grasa marrón en ratones con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.