この作品は、米国国防総省（BGとBC061403にDKにBC075554）、米国国立衛生研究所（; JC、JESとJWへCA100324、JESにCA77522、U54CA126511 JCとBGにJVRにU54GM064346）によってサポートされていました。我々は、顕微鏡、イメージングボックスとF4/80抗体のためのJ.ポラード（医学のアルバートアインシュタイン大学）の製造で助けM. RottenkolberのヘルプはD. Entenbergに感謝。

1。乳腺脂肪体に腫瘍細胞の注入を用いて蛍光腫瘍の発生： <ol><li> 80％コンフルエント - 40にDendra2タンパク質を（細胞質マーカーなど）を発現する細胞株を成長する。 </li><li> PBS W / OのCa 2で料理を少なくとも3回リンス+やMg 2 +。 </li><li> ° C細胞のほとんどはそれを振るために平らな表面に皿をヒットしてデタッチとなるまで37℃で10cmディッシュとインキュベート当たりトリプシンの3 mlを加え。 </li><li>皿からすべてのセルをすすぎ、そして同様に行列を収集するためにスクレーパー（ラバーポリス）を使用してください。 PBS 5 mlを加える。遠心操作中にカウントするように注してください。 </li><li> 5分間800gで遠心する。 </li><li>吸引し、5の濃度にPBSで再懸濁します- 10 6 / mlの 10倍。 （30分以内に注入）注入するまで氷上で保管してください。 </li><li>無菌フード内4から5週齢の雌の免疫欠損マウス（例えば、SCID）を含むケージを置きます。 </li><li> 70％エタノールで4日（腹部）ニップルの周りにスプレーしてください。 </li><li>乳腺脂肪体に0.1 mlを注入する。助手を見つけることができる場合は、一人は場所でマウスを保持することができます一方、他の挿入乳腺脂肪体の内側針。自分で注入している場合は、イソフルランを使用して光麻酔下にマウスを置く。 </li><li>腫瘍5-7 mmに成長した後、乳腺イメージングウィンドウ（MIW）を挿入してください。 注：別の方法として、いくつかのアプリケーションのために、MIWが健康な乳房脂肪パッドの上に挿入することができると細胞はその後注入することができます。そのアプローチは、生理的環境の中で一過性にトランスフェクションされた細胞のイメージングを可能にします。 </li></ol> 2。乳腺イメージングウィンドウ（MIW）のマニュアル製作： <ol><li> MIWs（図1A）は、生体適合性を保証するために、組織グレードプラスチックで作られています。手動の建設のために、我々は、5または10cmの皿を使用。 </li><li>でラテックス手袋を置く。 </li><li>組織培養皿を加熱し、加熱料理（我々はこのために1インチdremmelのビットを使用）に対して丸みを帯びた、ハードオブジェクトをプッシュすることで曲面をレコード生成。 </li><li>加熱されたカミソリの刃を使用して皿の中央を切り取ります。 </li><li>ドーム形のプラスチック製のベース（直径6〜7ミリメートル）の中央に穴を作るために小さな、円錐形のdremmelのビットを使用してください。 </li><li> dremmelでそれをサンディングし、さらにそれを提出することにより、プラスチックベースのエッジが完全に滑らかにしてください。 </li><li>ガラスのカバースリップのための平らな面を作るプラスチックベースの上を提出。提出された、平らな面の直径は9〜10ミリメートルでなければなりません。 </li><li>瞬間接着剤を使用して平らな表面上に接着剤8ミリメートルの円形ガラスカバースリップ（番号1）（シアノアクリレート系接着剤）。 </li><li>乾燥して接着剤（15分）を待ちます。 </li><li>外側（ガラスがどこにある）から、ベースの内側にパンクチュアeight縫合穴を作るために加熱された26G針を使用してください。穴は均等に離れてカバースリップの端0.5〜1ミリメートル、カバースリップの周りに分布しているはずだ。 </li><li> 5から0の縫合針を使って穴を広げる。 </li><li>プラスチックベースに穴に穴を開けると内側の表面が不均一になります。サンドペーパーを使用して、この表面が完全に滑らかにします。 </li><li>小さなブラシを使ってMIWから小さなプラスチックの粒子の手袋とブラシを変更します。 </li><li>脱イオン水でMIWを洗ってください。 </li><li> 70％エタノールを使用してMIWを洗ってください。それが完全に透明であるので、ガラスをきれいにするQ -ティップを使用してください。接着剤蒸気から現在の霧のスポットがある場合は、Q -ティップでアセトンを慎重に使用してください。 </li><li>各サイドで3時間UV照射によってMIWを滅菌する。 </li></ol> ：乳腺イメージングウィンドウ（MIW）のセミマニュアル製作プラスチック基材を作製するために、我々は現在、シリコーンゴム鋳型を使用していると、手作りのMIWsを使用して作成。金型は、ポリエステル樹脂を充填してから、すぐに一緒に参加して前面と背面元の両方の正確な複製を作成するシリコーンゴムの2つの部分から構成されます。液体ポリエステル樹脂は、一緒に午前9時10分混合し、完全に48時間で硬化ハード構造の結果さ。プラスチックは、分解または時間の経過とともに黄色になることなく、保護されたUVとアーカイブです。 ベースが硬化した後、ステップ2.8から2.16までは手動で製MIWsの場合と同じ方法で行われます。 3。 MIWの挿入： <ol><li> 4 番目の乳首周辺には、セルのタイプ（図1B）に応じて、腫瘍細胞の注射後に小さい（5-7 mm径）腫瘍数日/週が必要です。 Dendra2 photoswitchableタンパク質または他の蛍光タンパク質を発現する細胞の注入が使用される細胞株に依存して後どのくらいの時間が経過した。腫瘍が目に見えて壊死とすべきではなく、腫瘍の上に髪の正常な皮膚を持つ必要があります。壊死性腫瘍を持つマウスを安楽死されるべきである。 </li><li>無菌フード内滅菌布を下に手術レイのための無菌空間を準備します。滅菌gの部分を入れて途中でauze、そしてその周りにいくつかのMIWsと滅菌器具を築く：私たちは小さな標準はさみ、春のはさみ、microdissectingピンセット、microdissecting鉗子、ニードルホルダーを使用してください。滅菌綿棒、フードの隅に70％エタノールと滅菌手袋のボトルキープ。 </li><li>マウスは、HBSSに2.5％AVERTINのIP注入（20μlの/ g）を用いて無菌フード内で麻酔または、代わりに10μg/ kgのケタミン+ 10μg/ gのキシラジン（承認および発注については、動物のケア研究所にお問い合わせください）​​。 注：AVERTIN溶液を調製する必要が隔週、0.22μmのフィルターフィルターと4で500μlのアリコートとして保存されている使用して滅菌℃（暗所で）。 </li><li>小動物のシェーバーを使用して腫瘍の上の領域を削って、髪を取り外します。 </li><li> Nairさんの脱毛クリームを（任意のドラッグストアで入手可能）を使用して毛の残りの部分を削除します。エタノールに浸した綿棒を使って肌をきれいにします。 </li><li>滅菌ガーゼの上に動物を移し、乾燥や感染からそれらを保つために眼に眼軟膏を適用する。 </li><li> betadineで皮膚を殺菌し、70％エタノールで洗浄。 </li><li>無菌フード内滅菌外科布の上に動物を譲渡する。 </li><li>皮膚に鉗子とカット〜2mmの切開を使用してニップルにすぐに内側の皮膚を引っ張る。 </li><li>解剖ハサミとピンセットを用いて皮膚から、基礎となる乳房脂肪パッドを区切ります。 MIWの挿入を収容する大きさにこの分離工程の間に皮膚や穴のストレッチ。 </li><li>誤って血管がsugery中にヒットされている場合は、/過大になるの出血を止めるために作られている任意の血液を除去するために滅菌綿棒を使用してください。 </li><li>非吸収糸と逆方向カット針を使ってその場でMIWの基盤と縫合糸の上に皮膚があるようなMIWを挿入します。 </li><li>縫合穴を埋めると皮膚にMIWを確保するために組織接着剤またはシアノアクリレートを使用してください。 </li><li> TMP - SMX抗生物質ミックスを追加：（スルファメトキサゾール0.6 mg / mlの、トリメトプリム0.12 mg / ml）を手術の前後3日間ケージの水のボトルに。 </li><li>動物はAVERTIN IP注入後1 - 4Hのために麻酔下にとどまります。手術は一般的に〜45分かかるので、それは動物がその後回復に役立つことが重要です。 </li><li>ケージの底に手を加温パッド（37 ° C）を（薬局で入手可能）に置き、ガーゼをかぶせます。 </li><li>それはその胃をオンにして歩いて開始されるまでパッドの上に動物を保管してください。 </li><li>動物が3時間以上の間意識不明の場合は、水分補給のためのHBSS腹腔内に0.3 mlを注入する。 </li><li>動物は、最初のイメージングセッションが行われる前に、次の3-4日間にわたって回復するために許可されています。 </li></ol> 4。イメージングボックスの構造イメージングボックスは、MIWは、右の顕微鏡対物の上に、平らに座っていることを保証します。また、イソフルランの一定の空気の流れを通して、温度と麻酔の制御を容易にします。ボックスはプレキシガラス製とプラスチック製の溶接を使用してくっついています。それは特定の顕微鏡のステージに装着されているため、その底部の形状が（図2ライカSP5の顕微鏡ステージに取り付けられたボックスのスキームを示しています）使用顕微鏡によって異なります。 センチメートル単位でボックスの寸法はL = 11.4センチ、ワット= 7.6センチ、H = 4.4センチメートル（図2A）です。ボックスの下部には、ライカSP5の顕微鏡ステージ内に収まる中空板、サイズの12.7x8.4 cmの、二つのスライディング&quot;ドア&quot;、5.7 × 5.7 cm_each、円形の開口部を形成する（D = 2.22 cmの構成）閉じたとき。 MIWは、この開口部に収まる。サイド部分の一つが真空につながる出口穴が含まれている状態で、フロント部分は、麻酔の配信のための入口穴が含まれています。 コンデンサーとスライドホルダーは、イメージングボックスの配置する前に削除する必要があることに注意してください。 5。イメージングボックスの使用<ol><li>イソフルラン麻酔下で動物を置き、目に眼軟膏を適用する。 </li><li>入口の穴（図2B）の外側に、麻酔器からイメージングボックスの前面にイソフルラン排気を取り付けます。 </li><li>イメージングボックスの出口穴に2本目のチューブを取り付けます。このチューブは、ガスフィルターにして真空に接続する必要があります。 </li><li>ボックスの蓋を開き、ボックスの扉を開いて、動物、底部が直面しているMIWの側に配置し、ボックスに扉をスライド。 </li><li>ボックスを持ち、MIWのベースがそれらの間に保持し、固定化されるように、底部の扉を調整する。 MIWのカバースリップがこのレベルより下のわずか数ミリメートルでなければならない一方MIWのベースは、イメージングボックスのドアと同じレベルにする必要があります。下部の扉ボックスに平行、スライドドアを底面との間MIWの位置はカバースリップ（MIWのガラス部分）が平らになることを保証することを確認してください。これは、適切なピント合わせが保証されます。 </li><li>上のボックスの配置のためのスペースを可能にするために、顕微鏡対物レンズを下げる顕微鏡ステージの上。 </li><li>顕微鏡ステージ上にボックスを配置し、MIWのカバースリップが目標より上になるように段階を調整する。 </li><li>客観的にフォーカスし、イメージングを起動します。 </li><li>イソフルランの使用中に、動物が呼吸の周波数の目視検査によって監視する必要があります。これは、または画像コレクション（これらは、データ収集を妨げることができる）中に出現する呼吸のアーチファクトの頻度を監視することによって、視覚的に行うことができます。 MouseOxパルスオキシメトリーシステム（スター生命科学コーポレーション）が正常に使用されています。そうすればデータは、動物にチェックするために部屋の上のライトをオンにすることなく継続的に収集することができます。 注：各画像のセッションの後、動物の回復がガーゼまたはキムワイプで小さな手の加熱パッドをラップし、ケージの中に動物の下に置くことによって促進されるべきである。 注：浸対物レンズがMIWを通してイメージするために使用されている場合は、液浸媒体（グリセリン、水、油が）画像ウィンドウをオフに洗浄する必要があります。 MIWは、撮像中に発生した可能性のある亀裂やその他の損傷がないか点検してください。これは、複数のイメージングセッション中にデータを収集するために重要です。 </li></ol> 6。 Dendra2 -標識細胞のPhotoswitchingとイメージング手順は、ライカSP5共焦点顕微鏡のために説明されています。最適化するためのガイドとして使用される他の共焦点顕微鏡を使用するか、多光子イメージングをセットアップするときに焦点面でのレーザーのパワー、使用可能な目標とソフトウェアオプションは変わるため、プロトコルは以下のとおりあなたの顕微鏡での実験。 <ol><li>緑色の蛍光フィルターとアイピース（10倍）を介して腫瘍を観察することによって、目に見えて流れると同じ焦点面に平らに敷設されている主要な血管を探します。 </li><li> PMT検出へのフィールドとスイッチの中央の船の一つの位置。 </li><li> 2つのチャネルを連続イメージングのコレクションを設定します。チャネルの1つは488nmのレーザーライン（10％消費電力）を使用し、Dendra2（505 - 540nm）の緑色の形から細胞外マトリックス（480 - 495nm）と排出量からの散乱を収集します。番目のチャネルは、543nmのレーザライン（90％消費電力）を使用し、Dendra2の赤の形（555 - 600nmの）からの発光を収集します。 3D画像プリphotoswitchingを収集する。 </li><li>フォトスイッチに405nmのレーザーラインを（30％の電力、20-40スキャン）を使用してセルの選択された人口をROIスキャンオプションを使用します。スイッチングを監視するタンパク質の赤形の放射を収集する。 </li><li> 6.3のと同じシーケンシャルルーチンを使用して、ポストスイッチング3D画像を収集する。 </li><li>腫瘍内の複数の領域をphotoswitching場合、それは緑と赤の両方のチャンネル（図3A、B）で、デジタルカメラを使用して、接眼レンズを通して写真を撮影することをお勧めします。これにより、その後のイメージングセッション中に方向に役立ちます。 注：さらに、血管が一時的に蛍光デキストラン（カスケードブルー又はAlexa Fluor 647、両方10kDa）の尾静脈注射を用いて標識することができます。注射後数時間、デキストランは血管を残し、恒久的にマクロファージにラベルを付けます。 </li></ol>代表的な結果： 図3Cは、血管（無蛍光）からの相対直交指向長方形photoswitchedの領域（赤）を示しています。細胞外マトリックスからの散乱が紫のときに非photoswitched細胞は、緑色です。画像はZ軸（20-50μmの深さ）に沿って4つのイメージの最大強度投影です。

<ol>
	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein,+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy,+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis.">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li><li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+gene+expression,+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li><li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling.">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li><li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. 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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

シングルセルの解像度でマウスとラットの乳腺腫瘍の過去10年間で、生体顕微鏡<sup&gt; 1月4日</sup&gt;このような腫瘍細胞の遊走、浸潤や脈管内へのような転移挙動のメカニズムに重要な洞察をもたらした<sup&gt; 5、6</sup&gt;、血管新生<sup&gt; 3</sup&gt;と免疫細胞の応答<sup&gt; 7月9日</sup&gt;。我々は最近、生きているマウスでは複数の生体内イメージングセッションを介して画像同所性乳がんに手法を報告している<sup&gt; 10</sup&gt;。このため、我々はDendra2ための乳腺画像ウィンドウ（MIW）と最適化されたイメージングパラメータを開発している<sup&gt; 11</sup&gt; photoswitchingとイメージング<em&gt; in vivoで</em&gt;。ここで、我々はMIW、カスタム構築されたイメージングボックスを使用してDendra2標識腫瘍細胞の腫瘍と画像の上にMIWの挿入の製造のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、画像の腫瘍の異なる微小環境における腫瘍細胞の転移挙動をするために使用され、血管、腫瘍細胞と宿主細胞の長期的なイメージングを可能にすることができます。

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Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

乳腺画像ウィンドウを通してDendra2標識腫瘍細胞の生体内photoswitchingとトラッキングは、私たちは、画像間のタイムスケール上の選択された腫瘍の微小環境における腫瘍細胞の転移挙動をするという技術です。

乳腺イメージングの窓からDendra2 Photoswitching

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. 乳腺画像ウィンドウを通してDendra2標識腫瘍細胞の生体内photoswitchingとトラッキングは、私たちは、画像間のタイムスケール上の選択された腫瘍の微小環境における腫瘍細胞の転移挙動をするという技術です。

ビデオ: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

生物学

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

マウス乳腺上皮細胞は乳腺刺激分化の過程でMammospheresを形成し、

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

乳腺上皮移植の手順

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

マウス乳腺に局在薬物送達のための管内注入

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

乳腺生検する方法

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is key to understanding not only its life cycle, but also to uncover imbalances in the proteostasis network. This method shows how to track the degradation of the disease-causing protein huntingtin. Two versions of huntingtin fused to Dendra2 are expressed in the C. elegans nervous system: a physiological version or one with an expanded and pathogenic stretch of glutamines. Dendra2 is a photoconvertible fluorescent protein; upon a short ultraviolet (UV) irradiation pulse, Dendra2 switches its excitation/emission spectra from green to red. Similar to a pulse-chase experiment, the turnover of the converted red-Dendra2 can be monitored and quantified, regardless of the interference from newly synthesized green-Dendra2. Using confocal-based microscopy and due to the optical transparency of C. elegans, it is possible to monitor and quantify the degradation of huntingtin-Dendra2 in a living, aging organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 is partially degraded soon after conversion and cleared further over time. The systems controlling degradation are deficient in the presence of mutant huntingtin and are further impaired with aging. Neuronal subtypes within the same nervous system exhibit different turnover capacities for huntingtin-Dendra2. Overall, monitoring any protein of interest fused to Dendra2 can provide important information not only on its degradation and the players of the proteostasis network involved, but also on its location, trafficking, and transport.

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presented here is a protocol to monitor degradation of the protein huntingtin fused to the photoconvertible fluorophore Dendra2.

光変換可能なDendra2を用いた加齢C.エレガンスにおけるタンパク質代謝の定量化

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>乳腺の生体内細胞内顕微鏡検査

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

乳腺の生体内細胞内顕微鏡検査

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...