(; CA100324 um JC, JES und JW; U54GM064346 zu JvR CA77522 zu JES, U54CA126511 um JC und BG) Diese Arbeit wurde vom US Department of Defense (BC075554 zu BG und BC061403 zu DK), US-amerikanischen National Institutes of Health unterstützt. Wir danken D. Entenberg um Hilfe bei der Mikroskopie, M. Rottenkolber um Hilfe bei der Herstellung der Imaging-Box und J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) für die F4/80 Antikörper.

1. Generation von fluoreszierenden Tumoren durch Injektion von Tumorzellen in die Brustfettpolster: <ol><li> Baue eine Zelllinie, die Dendra2 Protein (als zytoplasmatischen Marker) zu 40 bis 80% Konfluenz. </li><li> Spülen Sie Geschirr mindestens 3-mal mit PBS w / o Ca 2 + oder Mg 2 +. </li><li> 3 ml Trypsin pro 10 cm Schale und bei 37 ° C, bis die meisten der Zellen und dann lösen traf das Gericht gegen eine ebene Fläche, um sie zu schütteln. </li><li> Spülen Sie alle Zellen von der Schüssel, und mit einem Schaber (Gummi Polizist) auf Matrix sowie zu sammeln. Fügen Sie die 5 ml PBS. Nehmen Sie ein Aliquot während der Zentrifugation zu zählen. </li><li> Zentrifugation bei 800 g für 5 min. </li><li> Absaugen und resuspendieren in PBS auf eine Konzentration von 5 - 10x 10 6 / ml. Auf Eis, bis injiziert (injizieren innerhalb von 30 min). </li><li> Legen Sie einen Käfig mit 4-5 Wochen alten weiblichen immundefizienten Mäusen (zB SCID) in einem sterilen Haube. </li><li> Sprühen Sie das Gebiet rund um die 4. (Bauch-) Nippel mit 70% Ethanol. </li><li> Inject 0,1 ml in Brustfettpolster. Wenn ein Assistent gefunden werden kann, kann eine Person mit der Maus in Position zu halten, während der andere fügt die Nadel in die Brustfettpolster. Wenn Sie selbst injiziert werden, legen Sie die Maus unter leichter Betäubung mit Isofluran. </li><li> Sobald der Tumor 5-7 mm gewachsen ist, sollte das Mamma-Imaging Window (MIW) eingefügt werden. Hinweis: Alternativ für einige Anwendungen, die MIW kann auf der Oberseite des gesunden Brustfettpolster eingefügt werden und die Zellen können dann injiziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Abbildung von transient transfizierten Zellen in einer physiologischen Umgebung. </li></ol> 2. Manuelle Herstellung der Mamma-Imaging Window (MIW): <ol><li> MIWs (Abbildung 1A) des Gewebes grade Kunststoff zur Biokompatibilität zu gewährleisten. Für die manuelle Konstruktion verwenden wir 5 oder 10 cm Gerichte. </li><li> Legen Sie Latex-Handschuhe über. </li><li> Erhitzen Sie eine Gewebe-Kulturschale und creat einer gekrümmten Oberfläche, indem Sie einen abgerundeten, harten Gegenstand gegen die beheizte Spiegel (verwenden wir eine 1-Zoll-dremmel Bit für diese). </li><li> Schneiden Sie die Mitte der Teller mit einem beheizten Rasierklinge. </li><li> Mit einem kleinen, kegelförmigen dremmel Bit, um ein Loch in der Mitte des kuppelförmigen Kunststoffboden (6-7mm Durchmesser) zu machen. </li><li> Machen Sie die Ränder der Kunststoffsockel völlig glatt durch Schleifen mit der dremmel und weitere Ablage es. </li><li> File die Spitze des Kunststoff-Basis macht eine ebene Fläche für das Deckglas. Der Durchmesser der eingereichten ebenen Fläche sollte 9-10mm sein. </li><li> Kleben Sie die 8mm runden Deckglas (Nummer 1) auf der Abflachung mit dem Sekundenkleber (Cyanacrylat-Klebstoff). </li><li> Warten Sie, bis der Leim trocken (15 Minuten). </li><li> Verwenden Sie einen beheizten 26G Nadel zu acht Naht Löcher Punktion von außen (wo das Glas) an der Innenseite der Basis zu machen. Löcher sollten gleichmäßig um das Deckglas verteilt werden, .5-1mm vom Rand des Deckglases. </li><li> Erweitern Sie die Löcher mit einem 5:0 Nähen Nadel. </li><li> Punktion Löcher in den Kunststoff-Basis wird die innere Oberfläche uneben. Mit Schleifpapier, machen diese Fläche vollkommen glatt. </li><li> Ändern Sie die Handschuhe und Pinsel von kleinen Kunststoff-Teilchen aus der MIW mit einer kleinen Bürste. </li><li> Waschen Sie die MIW mit entionisiertem Wasser. </li><li> Waschen Sie die MIW mit 70% Ethanol. Verwenden Sie ein Q-Tip auf das Glas sauber, so dass es vollkommen transparent ist. Wenn es neblig-Spots präsentieren aus dem Leim Dampf sind, verwenden Sie sorgfältig Aceton mit einem Q-Tip. </li><li> Sterilisieren der MIW durch UV-Bestrahlung für 3 h auf jeder Seite. </li></ol> Semi-Manual Herstellung der Mamma-Imaging Window (MIW): Um die Kunststoff-Basis herzustellen, sind wir derzeit mit Silikonkautschuk Gussformen erstellt mit handgefertigten MIWs. Die Form wird aus zwei Teilen aus Silikonkautschuk, dass eine exakte Nachbildung der Vorder-und Rückseite des Originals, wenn mit Polyester-Harz gefüllt und dann sofort zusammengefügt machen zusammen. Das flüssige Polyesterharz zusammen 9:10 Und gemischte Ergebnisse in eine harte Struktur, wenn vollständig in 48h geheilt. Der Kunststoff ist UV-geschützt und Archivierung ohne zusammenzubrechen oder zu gelb im Laufe der Zeit. Nachdem das Basissystem ist geheilt, nur wenige Schritte 2,8-2,16 die gleiche Weise wie für manuell-made MIWs getan. 3. Einsetzen der MIW: <ol><li> Der Bereich um die 4 th Brustwarze sollte eine kleine (5-7 mm Durchmesser) Tumor mehrere Tage / Wochen nach der Injektion der Tumorzellen abhängig vom Zelltyp (Abbildung 1B). Wie viel Zeit hat nach der Injektion von Zellen, die Dendra2 photoschaltbare Protein oder anderen fluoreszierenden Proteinen ist abhängig von der verwendeten Zelllinie vergangen. Der Tumor sollte nicht sichtbar nekrotisch, und sollte eine intakte Haut mit Haaren auf der Oberseite des Tumors. Mäuse, die mit nekrotischen Tumoren sollte eingeschläfert werden. </li><li> Bereiten Sie die sterile Raum für die Chirurgie-legen ein Stück sterilen Tuch in eine sterile Haube. Legen Sie ein Stück sterile gauze in der Mitte, und legen ein paar MIWs und sterilen Instrumenten herum: Wir verwenden kleine Standard-Schere, Feder Schere, Pinzette microdissecting, microdissecting Pinzetten, Nadelhalter. Halten Sie sterile Wattestäbchen, eine Flasche von 70% Ethanol und sterile Handschuhe in die Ecke der Motorhaube. </li><li> Die Maus ist in die sterile Haube betäubt mit IP Injektion von 2,5% Avertin (20 ul / g) in HBSS oder alternativ 10 ug / kg Ketamin + 10 pg / g Xylazin (kontaktieren Sie Ihren Animal Care Institut für Genehmigungen und Bestellung). Hinweis: Avertin Lösung zubereitet werden sollte zweimal wöchentlich, sterilfiltriert über einen 0,22 um Filter und gespeichert als 500 ul Aliquots bei 4 ° C (im Dunkeln). </li><li> Entfernen Sie Haare durch Rasur im Bereich oberhalb des Tumors mit einem kleinen Tier Rasierer. </li><li> Entfernen Sie den Rest der Haare mit Nair Enthaarungscreme (erhältlich in der Apotheke). Reinigen Sie die Haut mit Ethanol-getaucht Q-Tips. </li><li> Übertragen Sie die Tiere auf die sterile Gaze und gelten Augensalbe in die Augen, um sie vor dem Austrocknen und Infektionen zu halten. </li><li> Sterilisieren Sie die Haut mit betadine und sauber mit 70% Ethanol. </li><li> Übertragen Sie die Tiere auf einen sterilen OP-Tuch im sterile Haube. </li><li> Ziehen Sie die Haut sofort medial um die Brustwarze mit einer Pinzette und schneiden ~ 2mm Schnitt in der Haut. </li><li> Trennen Sie die zugrunde liegenden Brustfettpolster von der Haut mit Dissektion Schere und Pinzette. Die Haut und das Loch dehnen während dieser Trennung Schritt zu einer Größe, die Einführung der MIW beherbergen wird. </li><li> Wenn versehentlich ein Gefäß während sugery getroffen wird, mit einem sterilen Wattestäbchen, um das Blut, die produziert / ist, um die Blutung zu groß wird aufhören zu entfernen. </li><li> Legen Sie die MIW, so dass es der Haut auf der Oberseite des MIW Basis und Naht in Ort mit nicht-resorbierbaren Fäden und rückwärts schneidenden Nadel. </li><li> Verwenden Sie Gewebekleber oder Cyanacrylat in der Naht Löcher zu füllen und befestigen Sie die MIW auf die Haut. </li><li> Add TMP-SMX Antibiotika-Mix: (Sulfamethoxazol 0,6 mg / ml, Trimethoprim 0,12 mg / ml) in den Käfig Wasserflasche für 3 Tage vor und nach der Operation. </li><li> Das Tier bleibt in Narkose für 1-4h nach Avertin IP Injektion. Seit der Operation erfolgt häufig ~ 45min, ist es wichtig zu helfen, das Tier danach wieder her: </li><li> Legen Sie eine Hand Heizkissen (37 ° C) (erhältlich in Drogerien) auf dem Boden des Käfigs und decken Sie es mit Gaze. </li><li> Halten Sie das Tier auf der Oberseite des Pads, bis sie auf den Bauch dreht sich um und geht los. </li><li> Wenn das Tier bewusstlos ist seit mehr als 3h, injizieren 0,3 ml HBSS intraperitoneal für Rehydrierung. </li><li> Das Tier darf in den nächsten 3-4 Tage erholen, bevor die erste bildgebende Sitzung stattfindet. </li></ol> 4. Imaging Box Construction Die Imaging-Box gewährleistet, dass die MIW sitzt flach, rechts oberhalb des Mikroskop-Objektivs. Es erleichtert auch Temperatur-und Anästhesie-Kontrolle durch konstanten Luftstrom von Isofluran. Die Box ist aus Plexiglas und verklebt mit Kunststoff zu schweißen. Es ist für die spezifische Mikroskoptisch montiert und damit die Form seines Bodens variiert je nach Mikroskop (Abbildung 2 zeigt das Schema der Box ausgestattet, Leica SP5 Mikroskoptisch). Abmessungen der Box in Zentimetern l = 11,4 cm, B = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Abbildung 2A). Die Unterseite der Box besteht aus einem hohlen Platte, 12.7x8.4 cm groß, die innerhalb der Leica SP5 Mikroskoptisch passt, und zwei Schiebetüren &quot;Türen&quot;, 5,7 x 5,7 cm_each, die eine kreisförmige Öffnung (Form d = 2,22 cm ), wenn sie geschlossen. Die MIW passt in diese Öffnung. Das Vorderteil enthält das Einlassloch für die Anästhesie während einer der Seitenteile enthält eine Steckdose Loch, um das Vakuum führt. Beachten Sie, dass der Kondensator und der Diahalter vor dem Imaging-Box Platzierung entfernt werden müssen. 5. Imaging Box verwenden <ol><li> Legen Sie das Tier in Narkose mit Isofluran und gelten Augensalbe in die Augen. </li><li> Bringen Sie die Isofluran-Abgas aus dem Narkosegerät zur Bildgebung Feld vor, auf der Außenseite der Einlass-Loch (Abbildung 2B). </li><li> Bringen Sie eine zweite Röhre, die Auslassöffnung des Imaging-Box. Dieses Rohr sollte, um das Gas-Filter und dann das Vakuum angeschlossen werden. </li><li> Öffnen Sie den Karton Deckel und die Box zu öffnen Türen und platzieren Sie das Tier, MIW Seite nach unten, und schieben Sie die Türen in die Box. </li><li> Halten Sie die Box und stellen Sie den unteren Türen, so dass die MIW Basis gehalten wird und immobilisiert zwischen ihnen. Die MIW Base sollte auf dem gleichen Niveau wie die Bildgebung box Türen, während der MIW Deckglas nur wenige Millimeter unterhalb dieser Ebene sein sollte. Stellen Sie sicher, dass die Positionierung der MIW zwischen dem unteren Schiebetüren sorgt dafür, dass das Deckglas (Glas Teil der MIW) flach, parallel zum Boden Türen der Box. Dies gewährleistet eine korrekte Fokussierung. </li><li> Senken Sie die Mikroskop-Objektiv, um Platz für die Platzierung der Box ermöglichen aufSpitze des Mikroskops. </li><li> Legen Sie die Box auf dem Mikroskoptisch, und passen Sie die Bühne, so dass die MIW Deckglas über dem Ziel. </li><li> Fokus der objektiven und starten Bildgebung. </li><li> Bei der Verwendung von Isofluran, sollte das Tier durch visuelle Inspektion der Atemfrequenz überwacht werden. Dies kann visuell erfolgen, oder durch die Überwachung der Atemfrequenz Artefakten bei der Bildgebung Sammlung (diese können mit der Datenerfassung stören). Die MouseOx Pulsoxymetrie-System (Starr Life Sciences Corp) wurde erfolgreich eingesetzt. Auf diese Weise können die Daten kontinuierlich, ohne die Lichter in den Raum, um auf das Tier zu überprüfen gesammelt werden. Hinweis: Nach jedem Imaging-Sitzung, Tier-Erholung sollte durch Umwickeln eine kleine Hand Heizkissen in Gaze oder Kimwipes und legt es unter das Tier in den Käfig erleichtert werden. Hinweis: Wenn ein Eintauchen Ziel ist es, Bild durch die MIW verwendet, das Immersionsmedium (Glycerin, Wasser, Öl) sollen von der Imaging-Fenster reinigen. Die MIW sollten keine Risse oder andere Schäden, die während der Bildgebung aufgetreten sind inspiziert werden. Dies ist entscheidend für die Erhebung von Daten während mehrerer Imaging-Sitzungen. </li></ol> 6. Photoschalten und Bildgebung von Dendra2-markierten Zellen Das Verfahren ist für die Leica SP5 konfokalen Mikroskop beschrieben; der Laserleistung in der Brennebene, zur Verfügung Ziele und Software-Optionen variieren, wenn andere konfokalen Mikroskopen oder Multiphotonen-Imaging einzurichten und damit die unten beschriebenen Protokoll sollte als Leitfaden verwendet werden, um zu optimieren das Experiment auf dem Mikroskop. <ol><li> Durch die Beobachtung des Tumors durch das Okular (10x) mit dem grünen Fluoreszenz-Filter, suchen große Blutgefäße, die sichtbar fließen und die Verlegung in die gleiche Brennebene flach. </li><li> Position eines der Gefäße in der Mitte des Feldes, und wechseln Sie PMT-Detektion. </li><li> Set up sequentielle Bildgebung Sammlung für zwei Kanäle. Einer der Kanäle verwendet 488nm Laser-Linie (10% Leistung), und sammelt Streuung von extrazellulären Matrix (480-495nm) und Emission aus der grünen Form von Dendra2 (505-540nm). Der zweite Kanal wird die 543nm Laser-Linie (90% Leistung) und sammelt Emission der roten Form von Dendra2 (555-600nm). Sammeln Sie 3D-Bilder vor Photoschaltung. </li><li> Verwenden Sie den ROI-Scan-Option zu einem ausgewählten Population von Zellen mit dem 405nm Laser-Linie (30% Leistung, 20-40 Scans) Photoschalter. Sammeln Emission der roten Form des Proteins an die Vermittlungsstelle zu überwachen. </li><li> Mit der gleichen sequentiellen Routine wie in 6.3, sammeln post-Umschaltung von 3D-Bildern. </li><li> Wenn Photoschaltung mehr als eine Region in den Tumor, ist es ratsam, Bilder durch die Okulare mit einer digitalen Kamera aufnehmen, in grün und rot-Kanäle (Abbildung 3A, B). Dies wird in der Orientierung während der nachfolgenden Abbildung Sitzungen helfen. Hinweis: Zusätzlich Blutgefäße kann vorübergehend zu kennzeichnen mit tail-Injektion von fluoreszierenden Dextran (Cascade Blue oder Alexa Fluor 647, beide 10kDa). Ein paar Stunden nach der Injektion wird Dextrane lassen die Blutgefäße und dauerhaft beschriften Sie die Makrophagen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: 3C zeigt eine rechteckige photoswitched Region (red) orthogonal in Bezug auf das Blutgefäß (keine Fluoreszenz). Non-photoswitched Zellen sind grün, während die Streuung von der extrazellulären Matrix ist violett. Image ist ein Maximum Intensity Projection von vier Bildern entlang der Z-Achse (20-50 um Tiefe).

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	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. 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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

In den letzten zehn Jahren Intravitalmikroskopie von Brusttumoren bei Mäusen und Ratten in Single-Cell-Auflösung<sup&gt; 1-4</sup&gt; Hat in wichtige Einblicke in Mechanismen des metastasierten Verhalten wie Migration, Invasion und intravasation von Tumorzellen geführt<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, Angiogenese<sup&gt; 3</sup&gt; Und Immunzellen Antwort<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Vor kurzem haben wir eine Technik zur Bild orthotopen Mammakarzinom berichtet über mehrere intravitales Imaging-Sitzungen in lebenden Mäusen<sup&gt; 10</sup&gt;. Zu diesem Zweck haben wir ein Mammary Imaging Window (MIW) und optimierte Bildgebung Parameter für Dendra2 entwickelt<sup&gt; 11</sup&gt; Photoschaltung und Imaging<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Herstellung von MIW, Einsetzen der MIW auf der Spitze eines Tumors und die Abbildung der Dendra2-markierten Tumorzellen mit Hilfe eines speziell angefertigten Bildgebung ein. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bild die metastatische Verhalten von Tumorzellen in verschiedenen Mikroumgebungen in Tumoren werden und ermöglicht eine langfristige Darstellung von Blutgefäßen, Tumorzellen und Wirtszellen.

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Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Intravital Photoschaltung und Verfolgung von Dendra2-markierten Tumorzellen durch die Mammary Imaging-Fenster ist eine Technik, die uns zur Abbildung der metastatischen Verhalten von Tumorzellen in ausgewählten Tumormikromilieu über einer Zeitskala von Tagen erlaubt.

Dendra2 Photoschalten durch die Mammary Imaging Fenster

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Intravital Photoschaltung und Verfolgung von Dendra2-markierten Tumorzellen durch die Mammary Imaging-Fenster ist eine Technik, die uns zur Abbildung der metastatischen Verhalten von Tumorzellen in ausgewählten Tumormikromilieu über einer Zeitskala von Tagen erlaubt.

Serie: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Forschung

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Brustepithelzellen Transplantation

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

Bovine Brustdrüse Biopsie-Techniken

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is key to understanding not only its life cycle, but also to uncover imbalances in the proteostasis network. This method shows how to track the degradation of the disease-causing protein huntingtin. Two versions of huntingtin fused to Dendra2 are expressed in the C. elegans nervous system: a physiological version or one with an expanded and pathogenic stretch of glutamines. Dendra2 is a photoconvertible fluorescent protein; upon a short ultraviolet (UV) irradiation pulse, Dendra2 switches its excitation/emission spectra from green to red. Similar to a pulse-chase experiment, the turnover of the converted red-Dendra2 can be monitored and quantified, regardless of the interference from newly synthesized green-Dendra2. Using confocal-based microscopy and due to the optical transparency of C. elegans, it is possible to monitor and quantify the degradation of huntingtin-Dendra2 in a living, aging organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 is partially degraded soon after conversion and cleared further over time. The systems controlling degradation are deficient in the presence of mutant huntingtin and are further impaired with aging. Neuronal subtypes within the same nervous system exhibit different turnover capacities for huntingtin-Dendra2. Overall, monitoring any protein of interest fused to Dendra2 can provide important information not only on its degradation and the players of the proteostasis network involved, but also on its location, trafficking, and transport.

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presented here is a protocol to monitor degradation of the protein huntingtin fused to the photoconvertible fluorophore Dendra2.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...