Agradecemos al Dr. Richard Vallee y Shrestha Brikha para ayudar con el en el útero y técnicas ex vivo la retina de la electroporación, respectivamente, y el Dr. T. Sakurai a los comentarios de este protocolo. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Medicale, y el Human Frontier Science Program (AR) y EY12736 R01 (CM).

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

En este video, que han demostrado las técnicas de electroporación, tanto en el útero y ex vivo, para la entrega de genes en embriones murinos CGR. En el útero de la electroporación retina proporciona un mecanismo para la manipulación de la expresión génica en CGR y visualizar sus proyecciones de axones in vivo. Permitiendo que los embriones para sobrevivir después del nacimiento permite el examen de estas buenas prácticas agrarias + proyecciones RGC en su objetivo, el núcleo geniculado lateral (LGN). Ex electroporación in vivo retina proporciona una capacidad de más controlado para las regiones objetivo específico de la retina para su uso con los ensayos in vitro. La combinación in vivo e in vitro en los análisis derivados de estas técnicas permite la caracterización rigurosa del desarrollo RGC axón y las proyecciones en un subconjunto de la CGR en un segundo plano por lo demás normal. Mientras que nuestra manifestación se centra en la RGC para guía de axones en el quiasma óptico, tanto en el útero y ex vivo electroporations retina podría ser beneficioso para el estudio de cómo las perturbaciones en la diferenciación de efecto de la expresión génica RGC, morfología dendrítica, propiedades electrofisiológicas, la formación de sinapsis y la adecuada focalización en las zonas de terminación como el LGN y colliculus superior.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

La retina y su neurona de salida única, la de las células ganglionares retinianas (CGR), constituyen un modelo excelente para estudiar las cuestiones biológicas como la diferenciación celular, para guía de axones, la organización retinotópica y la formación de sinapsis [1]. Un inconveniente es la imposibilidad de manipular de manera eficiente y segura la expresión génica en la CGR en vivo, especialmente en el acceso de otro modo las vías visuales murino. Los ratones transgénicos se puede utilizar para manipular la expresión génica, pero este enfoque es a menudo costoso, consume mucho tiempo, y puede producir efectos secundarios no deseados. En pollo, en la electroporación in ovo se utiliza para manipular la expresión génica en la CGR para el examen de la retina y el desarrollo de RGC. Aunque las técnicas de electroporación similares se han desarrollado en las crías de ratón recién nacido [2], las ratas adultas [3], y la retina embrionaria murino in vitro [4], ninguna de estas estrategias permiten la caracterización completa de desarrollo RGC axón y las proyecciones en vivo. Con este fin, hemos desarrollado dos aplicaciones de electroporación, una en el útero y los otros ex vivo, para actuar específicamente sobre embriones murinos CGR [5, 6]. Con la electroporación en el útero de retina, que puede regular a la baja misexpress o genes específicos en CGR y seguir sus proyecciones axón a través de las vías visuales en vivo, lo que permite el examen de las decisiones de orientación a objetivos intermedios, tales como el quiasma óptico, o en regiones específicas, como la núcleo geniculado lateral. Perturbar la expresión génica en un subconjunto de la CGR en un fondo de tipo salvaje de lo contrario facilita el entendimiento de la función de genes a lo largo de la vía de la retina. Además, hemos desarrollado una técnica de compañía para el análisis de crecimiento de los axones CGR in vitro. Nos electroporar embrionarias cabezas ex vivo, recoger e incubar toda la retina, a continuación, preparar explantes de estos días retinas más tarde. Explantes de retina se pueden utilizar en una variedad de ensayos in vitro con el fin de examinar la respuesta de la electroporación axones de CGR a las señales de orientación u otros factores. En suma, este conjunto de técnicas de mejora nuestra capacidad de misexpress o regular a la baja en los genes CGR y en gran medida debería ayudar a los estudios que examinan el desarrollo y las proyecciones RGC axón.

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In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR) por<em&gt; En el útero</em&gt; Y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Electroporación. Estas técnicas permiten una para examinar cómo las alteraciones en la expresión de genes afectan el desarrollo del RGC, para guía de axones y las propiedades funcionales.

La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

18.7K vistas.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR) por En el útero Y Ex vivo Electroporación. Estas técnicas permiten una para examinar cómo las alteraciones en la expresión de genes afectan el desarrollo del RGC, para guía de axones y las propiedades funcionales.