Nous remercions le Dr Richard Vallee et Brikha Shrestha de l&#39;aide pour l&#39;in utero et ex vivo des techniques d&#39;électroporation de la rétine, respectivement, et le Dr T. Sakurai pour les commentaires sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes Health F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Médicale, et le Human Frontier Science Program (AR) et R01 EY12736 (CM).

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré techniques d&#39;électroporation, à la fois in utero et ex vivo, pour la livraison de gènes dans embryonnaire murin CGR. Électroporation in utero rétine fournit un mécanisme permettant de manipuler l&#39;expression des gènes dans les CGR et de visualiser leurs projections axonales in vivo. Permettre les embryons permet de survivre après la naissance examen de ces cellules GFP + projections CJR dans leur cible, le corps genouillé latéral (CGL). Ex vivo électroporation rétine fournit une capacité de plus contrôlée de cibles spécifiques des régions rétiniennes pour une utilisation avec des tests in vitro. Combinant in vivo et in vitro d&#39;analyses issus de ces techniques permet une caractérisation approfondie du développement et des projections axonales CJR dans un sous-ensemble de CGR dans un contexte par ailleurs normal. Alors que notre manifestation se concentre sur CJR axone d&#39;orientation au niveau du chiasma optique, à la fois in utero et ex vivo électroporations rétine pourrait être bénéfique pour étudier comment les perturbations dans la différenciation effet l&#39;expression des gènes du CJR, la morphologie dendritique, les propriétés électrophysiologiques, la formation des synapses et de ciblage approprié dans les zones de résiliation comme le LGN et colliculus supérieur.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

La rétine et ses neurones de sortie seule, la cellule ganglionnaires de la rétine (CJR), comprennent un excellent modèle dans lequel l&#39;examen des questions biologiques tels que la différenciation cellulaire, guidage axonal, organisation rétinotopiques et [1] la formation des synapses. Un inconvénient est l&#39;impossibilité de manière efficace et fiable de manipuler l&#39;expression des gènes dans les CGR in vivo, en particulier dans le autrement accessible murin voies visuelles. Les souris transgéniques peuvent être utilisés pour manipuler l&#39;expression des gènes, mais cette approche est souvent coûteux, prend du temps, et peut produire des effets secondaires indésirables. En poussin, de l&#39;électroporation in ovo est utilisée pour manipuler l&#39;expression des gènes dans le CGR pour examiner la rétine et le développement du CJR. Bien que les techniques d&#39;électroporation similaires ont été développés dans souriceaux nouveau-nés [2], chez le rat adulte [3], et embryonnaires murines in vitro de la rétine [4], aucune de ces stratégies permettent une caractérisation complète de développement et des projections axonales CJR in vivo. À cette fin, nous avons développé deux applications de l&#39;électroporation, une in utero et ex vivo d&#39;autres, de cibler spécifiquement embryon murin CGR [5, 6]. Avec l&#39;électroporation in utero de la rétine, on peut réguler négativement ou misexpress gènes spécifiques dans CGR et de suivre leurs projections axonales par les voies visuelles in vivo, permettant l&#39;examen des décisions d&#39;orientation à des objectifs intermédiaires, comme le chiasma optique, ou à des régions cibles, tels que le corps genouillé latéral. Perturber l&#39;expression des gènes dans un sous-ensemble de CGR dans un contexte autrement type sauvage facilite la compréhension de la fonction des gènes à travers la voie de la rétine. De plus, nous avons développé une technique d&#39;accompagnement pour l&#39;analyse de la croissance axonale CJR in vitro. Nous électroporation d&#39;embryons têtes ex vivo, de collecter et incuber toute la rétine, puis préparer les explants à partir de ces jours rétine plus tard. Explants rétiniens peut être utilisé dans une variété d&#39;essais in vitro afin d&#39;examiner la réponse des axones électroporées CJR à des signaux de guidage ou d&#39;autres facteurs. En somme, cet ensemble de techniques accroît notre capacité à réguler négativement ou misexpress gènes dans CGR et devrait grandement aider études examinant le développement du CJR et des projections axonales.

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In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Nous présentons ici deux techniques pour la manipulation de l&#39;expression génique dans des cellules murines ganglionnaires de la rétine (CGR) en<em&gt; In utero</em&gt; Et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation. Ces techniques permettent d&#39;examiner comment des altérations de l&#39;expression des gènes affectent le développement du CJR, guidage axonal, et les propriétés fonctionnelles.

En électroporation in vivo et ex utero pour l&#39;expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

18.7K vues.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Nous présentons ici deux techniques pour la manipulation de l'expression génique dans des cellules murines ganglionnaires de la rétine (CGR) en In utero Et Ex vivo Électroporation. Ces techniques permettent d'examiner comment des altérations de l'expression des gènes affectent le développement du CJR, guidage axonal, et les propriétés fonctionnelles.