우리는이 프로토콜에 대한 의견을 각각 utero 및 전직 생체내 망막 electroporation 기법에 도움을위한 닥터 리차드 발레와 Brikha Shrestha 감사, 박사 T. 사쿠라이. 이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 F31 NS051008 (TJP), Fondation 부어 라 레쳐치 Medicale하고, 인간 프론티어 과학 프로그램 (AR)와 R01 EY12736 (CM)에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

이 비디오에서는, 우리는 배아 murine RGCs에 유전자 전달에 대한 utero과 전 생체내 두 electroporation 기법을, 증명하고있다. utero에서 망막 electroporation은 RGCs의 유전자 발현을 조작을위한 메커니즘을 제공하며 생체내에서 축삭의 전망을 시각화. 배아는 생존을 수 있도록하는 postnatally 그들의 목표에 이런 GFP + RGC 계획의 심사 허가, 측면 geniculate 핵 (LGN)가. 예 생체내 망막 electroporation은 체외의 assays에 사용하기 위해 특정 망막 지역을 대상으로 더 많은 제어 기능을 제공합니다. 생체내 및 이러한 기술에서 파생된 체외 분석에 결합하는 것은 별도로 정상을 배경으로 RGCs의 하위 집합에 RGC 개발 및 축삭의 예측의 철저한 특성화 수 있습니다. 우리의 시위는 utero과 전직 생체내 망막 electroporations 어떻게 유전자 발현 효과 RGC 차별화, 돌기 형태, electrophysiological 속성 버렸네 형성과 적절한에서 perturbations 이러한 종료 지역 타겟팅 공부를 위해 도움이 될 수 모두 광 chiasm에서 RGC 축삭지도에 초점을 맞추고 있지만 LGN과 우수한 colliculus로.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

망막 및 단독 출력 뉴런의 망막 신경절 세포 (RGC)은 이러한 세포 분화, 축삭지도, retinotopic 조직 및 버렸네 형성 [1]과 같은 생물 학적 질문을 검토하는 훌륭한 모델을 구성. 하나의 단점은 효율적이고 안정적으로 특히 달리 접근 murine 시각 통로에 생체내에 RGCs의 유전자 발현을 조작하는 무능력이다. 유전자 변형 생쥐는 유전자 발현을 조작하는 데 사용하지만,이 접근법은 종종 시간이 소요 비용이며, 원치 않는 부작용을 만들 수 있습니다. 여자에서 비켜 electroporation의 망막과 RGC 발전을 검사에 대한 RGCs의 유전자 발현을 조작하는 데 사용됩니다. 유사한 electroporation 기법은 신생아 마우스 새끼 개발되어 있지만 [2], 성인 쥐 [3], 그리고 배아 murine retinae은 체외에서 [4],이 전략의 아무 생체내에 RGC 개발 및 축삭의 예측의 전체 특성을 허용하지 않습니다. 이를 위해, 우리는 구체적으로 배아 murine RGCs [5, 6]을 대상으로, electroporation 두 응용 프로그램 utero와 다른 전직의 생체내 한을 개발했습니다. utero 망막 electroporation에, 우리는 misexpress 또는 downregulate RGCs에서 특정 유전자를과 같은 광학 chiasm 같은 중간 목표, 또는 같은 이름으로 대상 지역에서지도 결정의 시험을 허용, 생체내에서 Visual 경로를 통해 축삭의 계획을 따를 수 측면 geniculate 핵. 달리 야생 타입을 배경으로 RGCs의 일부에서 유전자 발현을 Perturbing하면 망막 경로를 통해 유전자 기능의 이해를 용이하게합니다. 또한, 우리는 체외에서 RGC 축삭의 성장을 분석을위한 동반자 기술을 개발했습니다. 우리는 배아 머리 전직의 생체내을 electroporate 수집하고 전체 망막을 품어 후 나중에 해당 retinae 며칠에서 explants을 준비합니다. 망막 explants는지도 단서 또는 기타 요인에 electroporated RGC axons의 반응을 조사하기 위해 체외의 assays의 다양한에서 사용할 수 있습니다. 요컨대, 기술의 집합은 misexpress 또는 downregulate 유전자를 RGCs과 크게 RGC 개발 및 축삭의 계획을 검토 연구를 지원해야하는 우리의 능력을 향상시킵니다.

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In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을 제시<em&gt; utero에</em&gt;과<em&gt; 예 생체내</em&gt; electroporation. 이러한 기법은 한 유전자의 표현의 변경은 RGC 개발, 축삭지도 및 기능 특성에 미치는 영향 검토 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

18.7K 조회수.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. 여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을 제시 utero에과 예 생체내 electroporation. 이러한 기법은 한 유전자의 표현의 변경은 RGC 개발, 축삭지도 및 기능 특성에 미치는 영향 검토 수 있습니다.