Agradecemos ao Dr. Richard Vallee e Brikha Shrestha para ajudar com o in utero e ex vivo técnicas de eletroporação retinal, respectivamente, e Dr. T. Sakurai para comentários a este protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants F31 NS051008 (TJP), a Fondation pour la Recherche Medicale, ea Human Frontier Science Program (AR) e R01 EY12736 (CM).

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos técnicas de eletroporação, tanto no útero e ex vivo, para entrega de genes em embriões murinos RGCs. In utero eletroporação retinal fornece um mecanismo para a manipulação de expressão gênica em RGCs e visualizar suas projeções de axônio in vivo. Permitindo que os embriões de sobreviver após o nascimento permite a avaliação desses GFP + projeções RGC em seu alvo, o núcleo geniculado lateral (LGN). Ex eletroporação in vivo da retina fornece uma capacidade mais controlada para atingir regiões específicas da retina para uso com ensaios in vitro. Combinando in vivo e in vitro análises derivadas dessas técnicas permite a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra maneira normal. Enquanto a nossa manifestação se concentra em RGC orientação axônio no quiasma óptico, tanto no útero e electroporations ex vivo da retina pode ser benéfico para estudar como perturbações no gene de diferenciação efeito expressão RGC, morfologia dendrítica, propriedades eletrofisiológicas, formação de sinapses e adequada focalização em zonas de rescisão como o LGN e colículo superior.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

Da retina e sua neurônio de saída única, a células ganglionares da retina (RGC), constituem um excelente modelo para examinar questões biológicas, tais como diferenciação celular, axônio orientação, organização e formação de sinapses retinotopic [1]. Uma desvantagem é a incapacidade de maneira eficiente e confiável manipular expressão gênica em RGCs in vivo, especialmente nos de outra forma acessível murino caminhos visual. Camundongos transgênicos podem ser usados ​​para manipular a expressão do gene, mas esta abordagem é muitas vezes caro, demorado e pode produzir efeitos colaterais indesejados. No bico, na eletroporação in ovo é usado para manipular a expressão do gene em RGCs para o exame da retina e desenvolvimento RGC. Embora as técnicas de eletroporação semelhantes foram desenvolvidas em filhotes de rato neonatal [2], ratos adultos [3], e retinae embrionárias murinas in vitro [4], nenhuma dessas estratégias permitirá a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio in vivo. Para este fim, desenvolvemos duas aplicações de eletroporação, uma no útero e os outros ex vivo, especificamente alvo embrionárias murinas RGCs [5, 6]. Com eletroporação in utero da retina, podemos misexpress ou downregulate genes específicos em RGCs e siga suas projeções de axônio através das vias visuais in vivo, permitindo a análise de decisões de orientação em objectivos intermédios, como o quiasma óptico, ou em regiões-alvo, como o núcleo geniculado lateral. Perturbando a expressão de genes em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra forma tipo selvagem facilita a compreensão da função dos genes ao longo do percurso da retina. Além disso, temos desenvolvido uma técnica para analisar companheiro crescimento do axônio RGC in vitro. Nós electroporate embrionárias cabeças ex vivo, recolher e incubar toda a retina, em seguida, preparar explantes de retina estes dias mais tarde. Explantes da retina pode ser usado em uma variedade de ensaios in vitro, a fim de examinar a resposta de electroporated axônios RGC aos sinais de orientação ou de outros fatores. Em suma, este conjunto de técnicas aumenta nossa capacidade de misexpress ou downregulate genes em RGCs e deve ajudar muito o desenvolvimento de estudos examinando RGC e projeções axônio.

Watch this Scientific Journal Video about In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs) por<em&gt; In utero</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação. Estas técnicas permitem que se examine como as alterações na expressão dos genes afetam o desenvolvimento RGC, orientação axônio, e propriedades funcionais.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

18.7K visualizações.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs) por In utero E Ex vivo Eletroporação. Estas técnicas permitem que se examine como as alterações na expressão dos genes afetam o desenvolvimento RGC, orientação axônio, e propriedades funcionais.