Gli autori desiderano grazie ai membri del laboratorio di Houston per la lettura critica del manoscritto. La ricerca è supportata dal National Institutes of Health (GM083999) assegnato a DWH

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell&#39;ovaio <ol class="lalpha"><li> Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell&#39;esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l&#39;elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro una settimana. </li><li> Seleziona 3-5 femmine e posto uno in ~ 2L soluzione tamponata anestetico (Materiali). Cerchiamo di evitare di usare le rane che sono stati alimentati il ​​giorno o prima di un intervento chirurgico. Mentre la rana è cedere alla anestetico, disinfettare l&#39;area chirurgica con il 70% EtOH e preparare gli strumenti chirurgici. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici da parte di 20 secondi l&#39;immersione in uno sterilizzatore a caldo cordone a 250 ° C. I seguenti strumenti dovrebbero essere a portata di mano: manico bisturi (# 3) e la lama (# 10 o 11), diverse paia di Dumont pinze, forbici iris Bonn (curve o diritte), Halsey o Olsen-Hegar titolare micro aghi e suture. Luogo sterilizzati strumenti su piastra di Petri sterile o all&#39;interno del pacchetto di sutura per tenere sterile. Afferrare l&#39;ago nel porta-aghi con l&#39;orientamento desiderato prima di iniziare. Noi preferiamo Olsen-Hegar porta-aghi in quanto il manico contiene lame a forbice, che può essere usato per tagliare suture senza strumenti di commutazione. </li><li> Dopo 10 minuti, verificare che un aereo di anestesia chirurgica è stato raggiunto. Rane anestetizzato smetterà di muoversi e non risponde a un pizzico piedi o di essere capovolta. Anestesia dovrebbe durare 15 minuti, che è più che abbastanza tempo per eseguire le operazioni. Don abbigliamento adeguato chirurgico. Questo può includere guanti puliti (non-lattice), camici e mascherine chirurgiche, a seconda delle preferenze personali e istituzionali le linee guida la cura degli animali. </li><li> Nota sulla tecnica asettica: le secrezioni della pelle Frog contengono peptidi antimicrobici che in genere riducono l&#39;incidenza di contaminazione durante l&#39;intervento chirurgico, anche se la tecnica asettica deve essere seguita il più possibile. Teli chirurgici può essere utilizzato, ma non può essere richiesto da IACUCs istituzionali e non può fornire molto beneficio. Generalmente &quot;tecnica punta&quot; usato, dove le mani toccano le punte sterili del, materiale di sutura strumenti o sito di incisione. Gli strumenti possono essere risterilizzati (nello sterilizzatore tallone) incisione a seguito della pelle, e una zona sterile dovrebbe essere mantenuta sul bancone per gli strumenti che mette (come una capsula di Petri o un pacchetto di sutura). Requisiti istituzionali possono differire in modo significativo, quindi seguire le linee guida le vostre istituzioni &#39;e di ricevere adeguate istruzioni prima di eseguire interventi chirurgici. </li><li> Rimuovere la rana da anestetico e posto in decubito dorsale su un chirurgico umido pulire. Nota. La pelle può essere pulito con il risciacquo di iodio povidine diluito (1:20) o clorexidina (0,75%). Tuttavia, evitare commerciale scrub chirurgico, saponi e il 70% di alcol isopropilico, poiché possono danneggiare la pelle delicata di anfibi. </li><li> Usando un bisturi, forbici o piccoli iris, fare un piccolo (1 - 1,5 cm) incisione nella pelle nella parte inferiore dell&#39;addome, laterale alla linea mediana. Incisioni successive sulla stessa rana deve essere eseguita su lati alterni, ben distanziati gli uni dagli altri. Le incisioni possono essere effettuate sia parallela o perpendicolare alla linea mediana. </li><li> Rendere la pelle e le incisioni dei muscoli addominali in due fasi. Dopo il taglio della pelle, sollevare lo strato muscolare e circonda di colore bianco fascia con una pinza e fare l&#39;incisione nel muscolo sollevato. Usare le forbici e tagliare verso il basso, cercare di fare un taglio rapido per esporre le cavità del corpo lasciando margini della ferita pulita. Se solo la fascia è tagliata, si rientra e renderanno più difficile la sutura. Sollevare il muscolo evitare inavvertitamente ferire qualsiasi organi interni. Inoltre, cercare di evitare il taglio tramite qualunque cuori linfatici visibili o vasi sanguigni all&#39;interno degli strati muscolari. Estendere la lunghezza con le forbici del taglio in modo che ovaie possono essere facilmente tirato attraverso. </li><li> Ovaio deve essere chiaramente visibile una volta che l&#39;incisione viene fatta. Per procurarsi i ovaio, afferrare con una pinza e esternare il tessuto ovarico. La quantità desiderata di tessuto viene rimosso e rifilata a livello della parete del corpo. Non roba del tessuto indietro nella cavità celomatica, in quanto ciò potrebbe essere fonte di infezioni o altre complicazioni. </li><li> Subito osservare un piccolo pezzo di ovaio sotto un microscopio da dissezione e defolliculate uno ovociti pochi per testare la loro qualità. Essi dovrebbero essere fermi e di dimensioni uniformi e colorazione. Se sono accettabili, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico e suturare l&#39;incisione. Abbastanza per riempire un 90 millimetri piatto di Petri è solitamente sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Se gli ovociti sono di qualità discutibile, sutura la rana e ripetere con una donna diversa. </li><li> Chiudere l&#39;incisione di sutura il muscolo e lo strato prima fascia. Inserire il n<html> eedle pochi millimetri laterale per l&#39;incisione, avendo cura di passare attraverso lo strato di fascia pure. Suture solo attraverso il muscolo può strappare il tessuto e allentarsi. Usare pinze per inserire l&#39;ago da sotto sul lato opposto della incisione. Rilascio e ri-comprendere l&#39;ago dall&#39;esterno del corpo e tirare la sutura attraverso fino a diversi centimetri o giù di lì della coda rimane, facendo attenzione a non tirarlo fino in fondo. </li><li> Chiudere la ferita con un semplice modello interrotto di sutura. Usiamo un legame fondamentale strumento per rendere chirurgo nodi quadrati (nodi scogliera). Anello l&#39;estremità lunga della sutura intorno al titolare ago, afferrare la coda e tirarlo attraverso il ciclo verso di voi e stringere. Loop e tirare attraverso, questa volta tirare il titolare ago lontano da voi. Un terzo lancio può essere utilizzato per una maggiore sicurezza (nella stessa direzione del primo). Tagliare la sutura, lasciando la coda corta e farne un&#39;altra sutura nel muscolo pochi millimetri di distanza. Due punti di sutura sono sufficienti per piccole suture, tre per quelle più grandi. Ripetere l&#39;operazione per lo strato di pelle. Dimostrazioni video della tecnica di sutura di base sono disponibili su YouTube - la ricerca di &quot;legare strumento&quot;, ci sono un bel po &#39;tra cui scegliere, anche se la tecnica di base è la stessa. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero fresco (18 ° C). Mentre in laboratorio, le rane sono tenuti in acqua di rubinetto trattata con Amquel per rimuovere clorammine. Ogni pochi minuti, sollevare delicatamente la rana dall&#39;acqua e cercare ingoiare o occhi sporgenti movimenti, indicative di ripresa dall&#39;anestesia. </li><li> Nota: Chirurgia La sopravvivenza non è strettamente necessario per ottenere tessuto ovarico, anche se le femmine continuerà a produrre ovociti buoni dopo un certo numero di operazioni. L&#39;esecuzione di interventi chirurgici sopravvivenza anche ridurre il numero degli animali utilizzati. Assicurati di seguire le linee guida dell&#39;unità di cura degli animali sui metodi di vertebrati chirurgia sopravvivenza, post-op cura e monitoraggio e per numero di interventi chirurgici ammessi su un individuo. </li></ol> 2. Coltura e oociti Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Subito dopo l&#39;intervento è terminato, suddividere l&#39;ovaio in piccoli pezzi (circa 2 cm 2) e conservare in OCM fresco, con 5-6 pezzi al piatto 90 mm. Lobi individuali di ovaio vengono tagliati aperti, appiattita e tagliate a pezzi quadrati. Questi sono risciacquati in OCM pulito e messo in piatti per la cultura. Appiattimento e dividendo l&#39;ovaio estenderà la sua vita di cultura e di rendere più facile defolliculation. </li><li> Spostare un lobo di un piccolo piatto di OCM e manualmente defolliculate 300-500 ovociti. Ovociti mediante trasferimento sterile, fuoco lucido pipetta. Abbiamo scoperto che utilizzando il cotone collegato varietà è essenziale per minimizzare la contaminazione delle culture. Conservare gli ovociti a 18 ° C in 8 mL OCM (in piatti di media (Falcon 1007)) in gruppi di 100-150. Con la pratica, si dovrebbe essere in grado di defolliculate ovociti abbastanza in 1-2 ore. Ovociti Collagenased non sono adatti per il trasferimento di ospitare in quanto non è fertilizable. </li><li> Defolliculating metodo. Noi defolliculate con pinze (Dumont o # # 4s 5s, Strumenti Scienza Fine) orologiai &#39;, seguendo i metodi descritti in base Smith et al., (1991). Utilizzando un paio di pinze (in mano dominante), afferrare la teca strato di tessuto connettivo che circonda un adulto ovocita VI tappa vicino a dove il follicolo è collegato l&#39;ovaio (il gambo). Con l&#39;altra coppia di pinze, afferrare l&#39;ovaio adiacente alla prima coppia. Leggermente lacerare lo strato follicolo tirando attraverso l&#39;ovocita. Delicatamente stuzzicare l&#39;ovocita fuori del tessuto. Ovociti con successo defolliculated sono floppier di ovociti semplicemente tirato fuori senza rimuovere lo strato follicolo e sarà priva di vasi sanguigni visibili. </li><li> Nota: E &#39;essenziale per mantenere la pressione molto leggera sulle punte della pinza, appena sufficiente per le punte di incontrare. Serraggio troppo stretto è un comune tra i principianti e comporterà l&#39;ovocita di essere tirato via con il follicolo intatto. Mantenere un buon paio di pinze in esclusiva per defolliculating. Le punte devono soddisfare in modo preciso e dovrebbe essere leggermente più schietto pinze per fare espianti da embrioni di Xenopus (Figura 1). </li><li> Noi abitualmente prova matura circa 20 con progesterone e interrompere l&#39;esperimento se il tasso di maturazione è scarsa (&lt;50% dopo 6-7 ore a temperatura ambiente). </li><li> A questo punto, gli ovociti possono essere manipolati e colto come desiderato, come la microiniezione di oligo, morfolino o mRNA. Procedure di iniezione variare in base alla laboratorio, in modo da non descrivere quei qui. Ovociti può essere mantenuta fino a una settimana di OCM, ma in generale la salute declina quindi è meglio usarli per il trasferimento entro 96 ore di isolamento. </li><li> Tenete presente che solo cinque a sei gruppi (tra cui un controllo) possono essere trasferiti su una singola femmina, a causa di limitazioni di coloranti vitali, in modo da pianificare la sperimentazione di conseguenza. </li></ol>&quot;&gt; 3. Maturazione degli ovociti e la stimolazione di femmine ospitanti <ol class="lalpha"><li> Se si esegue un salvataggio di esaurimento oligo, iniettare il mRNA (di solito 5-30 pg di RNA) ~ 24-48 ore dopo l&#39;oligo. L&#39;oligo avrà degradata da questo momento e non dovrebbe incidere sulla RNA iniettato. </li><li> La sera prima di eseguire il trasferimento, aggiungere 16 ml di soluzione di progesterone di lavoro (1 mm di EtOH) di ovociti in 8 OCM mL in piatti di mezzo (concentrazione di progesterone finale è ~ 2 mM). Incubare per 10-12 ore a 18 ° C per consentire la maturazione degli ovociti. </li><li> Iniettare 3-5 femmine con 1000 unità per rana di hCG per indurre la deposizione delle uova. I nostri esperimenti sembrano funzionare meglio se la maturazione degli ovociti e l&#39;iniezione di hCG sono fatte nello stesso periodo, circa 12 ore prima dell&#39;impianto nell&#39;ospite (ad esempio, 22:00 AM -10). Lascia femmine a RT o 18 ° C durante la notte. </li></ol> 4. Preparazione e colorazione colorante vitale di ovociti <ol class="lalpha"><li> La mattina del trasferimento, permettono ~ 45-60 &#39;a impostare ed eseguire la procedura. A questo punto, gli ovociti maturi possono essere congelati per una successiva analisi dell&#39;efficacia del knockdown mRNA o espressione della proteina. Inoltre, controllare che gli ovociti non sono stati infettati e che c&#39;era un buon tasso di maturazione (&gt; 50%). Ovociti infetto non si fecondano. Scongelare coloranti vitali (Materiali) e far girare a velocità massima per 5 min. </li><li> Colori diversi gruppi sperimentali con l&#39;aggiunta di 80 ml di colorante appropriato vitale (s) ai piatti ovocita e incubare con dondolo per 15 &#39;. Durante questo periodo, selezionare una femmina ospite e iniziare l&#39;anestesia. Scegli una rana che sta lentamente le uova in modo normale o quella che produce le uova con abbondante spremitura mite. Uova dal host deve essere di buona qualità. Evitare di femmine che gettano le stringhe di uova o uova schiacciati. </li><li> Trasferire le uova colorate di un grande piatto di OCM fresca, agitare brevemente di lavare e metterle da parte prima del trasferimento. </li><li> Preparare una pipetta Pasteur sterile, con un alesaggio ampio abbastanza da ospitare un ovocita (~ 1,5 mm) per l&#39;utilizzo in trapiantare gli ovociti. Punteggio ottenuto la pipetta con una matita diamante e rompere pulito. Fuoco fino a lucidare i bordi sono lisce, facendo attenzione a non sciogliere l&#39;apertura. </li></ol> 5. L&#39;esecuzione del trapianto degli ovociti <ol class="lalpha"><li> Trapianto ovocita utilizza le stesse procedure chirurgiche, come descritto nella parte I, anche se invece di rimuovere ovaie, gli ovociti vengono manipolati inserito nella cavità del corpo con una pipetta. Idealmente, la procedura di trasferimento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la dimensione dell&#39;incisione deve essere mantenuto il più piccolo possibile. </li><li> Anesthesize la femmina ospite e preparare gli strumenti chirurgici, come descritto nella parte I. Marca e incisione, come descritto nella parte I. L&#39;incisione può essere più piccolo, ma deve essere grande abbastanza da contenere il foro della pipetta di trasferimento (Figura 2A). </li><li> Per il trapianto di ovociti, afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia con una pinza e introdurre gli ovociti sperimentale utilizzando la pipetta Pasteur preparato in precedenza. Agitare il piatto di ovociti per raccoglierli nel centro e succhiare il maggior numero possibile. Lasciare gli ovociti di stabilirsi nella fine della pipetta per evitare che il liquido in eccesso di essere introdotto e inserire la punta della pipetta in incisione e lentamente permettere gli ovociti di filo nella cavità del corpo (Figura 2B). Ripetere fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti. Non rilasciare lo strato muscolare in qualsiasi momento, fino a quando non hanno iniziato sutura, o gli ovociti saranno fuoriuscite di incisione. </li><li> Una volta che gli ovociti sono stati trasferiti, afferrare entrambi i lati della ferita con una pinza e metterli insieme, permettendo al ovociti di stabilirsi nella cavità del corpo. Iniziare la sutura come descritto, avendo cura di mantenere la tensione verso l&#39;alto sul muscolo e fascia fino al primo nodo è legato (Figura 2C). Ciò manterrà gli ovociti di essere espulsi e consentirà ai bordi della ferita per guarire in modo uniforme. Aggiungere un altro sutura nel muscolo / fascia livello e poi sutura la pelle. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero raffreddata (18 ° C) Amquel trattati con acqua. Monitorare il suo recupero dall&#39;anestesia come sopra. Lei dovrebbe iniziare le uova normalmente dopo l&#39;operazione. </li><li> Ottenere testicoli da una rana maschio con le normali procedure. Conservare i testicoli nella OCM o L15 fino al momento dell&#39;uso. Noi preferiamo testicolo fresco quando la concimazione esperimenti di trasferimento. </li></ol> 6. Recupero degli ovociti e la fecondazione in vitro <ol class="lalpha"><li> Ciglia peritoneale guiderà le uova trasferiti (e normale uova celomatica dell&#39;ospite) per le aperture dei ovidotti nella parte anteriore della cavità del corpo. Uova colorate possono essere recuperati all&#39;inizio 2-3 ore dopo il trasferimento dalla spremitura normale. Le uova possono essere ottenuti ogni mezz&#39;ora o giù di lì fino a quando la donna smette di posa. </li><li> Fertilizzare in una spesospensione rm (in ~ 4 mL 1x MMR) per 4 minuti. Flood e risciacquare a lungo con MMR 0.1x. Le uova dovrebbero attivare normalmente e inizierà a fendere ~ 1,5-2 ore dopo la fecondazione. Uova trasferiti spesso unirà poco più tardi le uova di accoglienza. </li><li> Rimuovere le mani gelatina con cisteina come embrioni normali e ordinare in piatti separati. Questo può essere fatto in qualsiasi momento, a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. E di solito più facile identificare i vari colori intorno al 4-celle palco e più difficili durante le fasi finali blastula. Cultura le uova a bassa densità (&lt;50 per piatto medio) in pulito MMR 0.1x. Da questo punto, gli embrioni possono essere trattati e manipolati normalmente. </li><li> Ritorna le rane alla struttura animale e monitor per le complicazioni nei prossimi giorni. </li><li> Fecondazione metodo alternativo; deposizione delle uova nel buffer di sale <ol class="lroman"><li> Dopo la rana si è ripreso dall&#39;anestesia, il suo posto in ~ 1L alto sale MMR (1,2 x). Lasciare che la femmina a deporre le uova nel buffer per circa 4-6 ore. Spremere le uova restanti, scolarli MMR 1.2x e ordinare uova colorate nel piatto pulito; rimuovere tutto il liquido possibile. </li><li> Lavare a lungo con MMR 0.3x e fertilizzare in volume minimo di 0.3x MMR / sperma sospensione fino attivare uova (10 minuti). Flood con MMR 0.1x e la cultura come sopra. Questa opzione è utile se le uova sono necessarie molte nella stessa fase o se la spremitura manuale di uova danni degli ovociti donatore. </li></ol></li></ol>

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Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Iowa IACUC Comitato.

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale&gt; 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L&#39;impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni grup...

Soluzioni e ricette: OCM (terreno di coltura degli ovociti; modificato da Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% di L-15 a medio Leibovitz (contenente l-glutammina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA; V frazione) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicillina-streptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiustare il pH a 7,6-7,8 con 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale, conservare a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Soluzione di Marc modifica di Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> regolare a pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestetico soluzione <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoic di etile (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / l di sodio bicarbonato </td></tr><tr><td colspan="2"> Sciogliere in Amquel trattati con acqua </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale </td></tr></tbody></table> Progesterone scorte <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterone 10 mM (Sigma P-0130) in 100% etanolo </td></tr><tr><td> Diluire a 1 mm di EtOH 100% per uno stock 500x / soluzione di lavoro </td></tr><tr><td> Conservare a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Coloranti vitali (modificato da Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blu: 0,1% Nilo Azzurro A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Rosso: 0,25% Rosso neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Marrone: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 microlitri blu + 80 microlitri marrone), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 microlitri blu + 80 rosso microlitri). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un colore sesto, arancione (80 + 80 microlitri rosso bruno microlitri), possono essere utilizzati, ma è spesso difficile da distinguere da marrone. </td></tr></tbody></table> Gli stock di blu, rosso e Brown sono preparati in acqua deionizzata a 50 ml provette, incubate per 20 minuti con dondolo e filato in una centrifuga clinica. I surnatanti sono aliquotted in provette da microcentrifuga e conservati a -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l&#39;ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L&#39;host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedura per la concimazione<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

14.5K Views.  University of Iowa. Procedura per la concimazione Ovociti di Xenopus Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Video: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Trasferimento nucleare in oociti mouse

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Studio del danno al DNA con Checkpoint<em&gt; Xenopus</em&gt; Uovo Estratti

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...