Libere los complejos de anillos de cromatina lexA CBP de las perlas magnéticas utilizadas para purificar el locus del gen de copia única de la cromatina incubando a las abejas con dos microlitros de virus de grabado de tabaco recombinante marcado con 6xHis o proteasa TEV. Después de separar las abejas del eluido final mediante una transferencia de rejilla magnética, el eluido que contiene anillos de cromatina escindidos a un nuevo tubo de reacción de 1,5 mililitros. Nuevamente, coloque los tubos en una rejilla magnética para separar las perlas residuales del eluido final.
Vuelva a suspender las perlas en 750 microlitros de tampón de carbonato de amonio frío antes de almacenar algunas muestras a 20 grados centígrados para el análisis de ADN y proteínas. A partir del eluido final, sacar las muestras y almacenarlas a 20 grados centígrados para el análisis de ADN y proteínas. Además, tome muestras de las cuentas residuales.
Comience la elución de desnaturalización lavando las perlas magnéticas dos veces en 750 microlitros de tampón de carbonato de amonio frío durante 20 minutos cada una, cuatro grados centígrados girando a 20 revoluciones por minuto. A continuación, agregue 500 microlitros de hidróxido de amonio 0,5 molar a las perlas para extraer los complejos de cromatina lexA unidos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Separe las perlas de la suspensión con una rejilla magnética y transfiera el eluido a un tubo de reacción de baja unión.
Incubar el tubo de reacción de baja unión a temperatura ambiente durante 30 minutos y separar las perlas de la suspensión con una rejilla magnética. Una vez hecho esto, transfiera el eluido a un tubo de reacción de baja unión. Resuspenda las perlas en 750 microlitros de agua desionizada y recoja muestras para el análisis de ADN y proteínas.
Por último, obtener muestras de análisis de ADN y proteínas del eluido final. En el estudio, se cuantificó la eficiencia de purificación del locus ARS316 y la cepa de recombinación y se comparó con el locus control PDC1. El locus ARS316 mostró una menor recuperación en el flujo en comparación con PDC1.
Aunque una fracción de los anillos de cromatina permanecieron unidos a las perlas de TEV debido a la escisión incompleta de la proteasa de TEV, la elución por desnaturalización dio lugar a una recuperación del locus de ARS316 del 80 al 90%. Esto corresponde al alto enriquecimiento de las moléculas de ARS316 en las perlas de TEV y a las fracciones de elución de desnaturalización cuando se tiene en cuenta el tamaño del genoma de la levadura en comparación con la cepa de control que no mostró enriquecimiento del locus de ARS316 en ninguna de las fracciones cuantificadas. Después de la elución de TEV, las perlas mostraron un mayor porcentaje de recuperación del locus ARS316 ya que la eficiencia de escisión de TEV no fue del 100%, lo que dio como resultado que una fracción de los anillos de cromatina permanecieran unidos a las perlas.
Sin embargo, la elusión desnaturalizante mostró una recuperación del 80 al 90% del locus ARS316 y la cepa de recombinación correspondiente al alto enriquecimiento de las moléculas de ARS316 cuando se tuvo en cuenta el tamaño del genoma de la levadura.
