Para comenzar, prepare citrato 10 veces concentrado, solución de recuperación objetivo o TRS de pH seis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dilúyelo en una proporción de 1:10 con agua desionizada. Luego caliente la solución en un frasco de tinción de plástico a 96 grados centígrados.
Retire los portaobjetos de la rejilla de portaobjetos y colóquelos en una cámara húmeda. A continuación, pipetee una o dos gotas del agente reductor de autofluorescencia en cada muestra de tejido e incube las muestras durante cinco minutos. Vuelva a apilar los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y enjuague durante un minuto en etanol al 60 % con movimientos hacia arriba y hacia abajo para eliminar el reactivo reductor de autofluorescencia no utilizado.
Sumerja la rejilla deslizante en agua desionizada durante cinco minutos. Transfiera los portaobjetos a un frasco de tinción con tampón TRS precalentado para la recuperación de antígenos. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos a 96 grados centígrados en un baño de agua.
Retire el frasco de tinción y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 a 90 minutos. A continuación, retire el TRS mientras mantiene los portaobjetos en el frasco. Enjuague los portaobjetos dos veces con solución salina tamponada TRIS que contiene 0.05% Tween a pH 7.4 durante tres minutos cada una para eliminar cualquier residuo restante de TRS.
Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda. Limpie suavemente el exceso de agua de los portaobjetos con pañuelos de papel, luego rodee cada muestra con un bolígrafo de barrera hidrofóbica para evitar que la solución de anticuerpos se escurra.
