Comience pipeteando una gota de solución bloqueante lista para usar con suero de burro sobre las muestras de tejido. A continuación, incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire el exceso de solución de bloqueo de los portaobjetos golpeando el borde contra una superficie dura.
Diluir los anticuerpos primarios en el tampón de dilución de anticuerpos para preparar 100 microlitros de la solución final para cada muestra. Configure los anticuerpos, un tubo para cada anticuerpo primario y uno para cada anticuerpo de isocontrol. Distribuya uniformemente 100 microlitros de anticuerpos de isocontrol a una muestra y 100 microlitros de mieloperoxidasa e histona citrulinada H3, o dilución de anticuerpos contra la mieloperoxidasa y la neutrofila elastasa a la otra muestra.
Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda y guárdelos durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retira el exceso de solución de anticuerpos primarios de los portaobjetos y apílalos en una cubeta. Enjuague los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno con solución salina tamponada Tris con interpolación para eliminar la solución de anticuerpos primarios restante.
Preparar dos anticuerpos secundarios claramente fluorescentes, anti-cabra de burro para mieloperoxidasa y anti-conejo de burro para tinción de histonas H3 citrulinadas. Diluya cada anticuerpo a 7,5 microgramos por mililitro de concentración en el tampón de dilución de anticuerpos. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda y dispense 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios en cada muestra.
Incubarlos durante 30 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Elimine el exceso de solución de anticuerpos secundarios golpeando los portaobjetos. Coloque las diapositivas en un soporte para diapositivas.
Sumerja los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno en un frasco de tinción lleno de PBS para eliminar los anticuerpos no unidos. Prepare la solución dappy y dilúyala a una concentración de un microgramo por mililitro con agua desionizada. Sumerja la rejilla de portaobjetos en un frasco de tinción que contenga la solución húmeda e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, sumerja la rejilla portaobjetos en un frasco de tinción con PBS durante cinco minutos para eliminar el exceso de solución húmeda. Por último, monte las muestras utilizando cubreobjetos y medio de montaje. El anticuerpo de histona H3 citrulinada solo se unió a las histonas extracelulares y no mostró tinción de histonas intracelulares.
El anticuerpo mieloperoxidasa específico para humanos o ratones no mostró tinción específica. Mientras que los anticuerpos universales humanos y de ratón mostraron una buena tinción consistente para la mieloperoxidasa. Cuando no se utilizó ningún agente bloqueante, algunas muestras de ratón mostraron más tinción positiva parcial e inespecífica.
Cuando se bloqueó, el tiempo de bloqueo de cinco minutos mostró buenos resultados en comparación con el tiempo de bloqueo de 10 minutos. Las temperaturas más altas en el microondas y el baño de agua mostraron consistentemente una recuperación de antígeno de moderada a buena. Mientras que en un baño de agua a 60 grados centígrados solo hubo una tinción parcialmente positiva o nula.
Para la doble tinción, se obtuvieron resultados más favorables para las muestras incubadas a 96 grados centígrados baño maría. Sin embargo, exceder el tiempo de incubación de 40 minutos a 96 grados centígrados resultó en una tinción de anticuerpos menos intensa.
