Para empezar, descongele las existencias de retrovirus RCAS(A)en hielo. Para evitar la obstrucción de la micropipeta, centrifugue la solución a 10.000 g durante 10 segundos a cuatro grados centígrados y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo mientras mantiene las soluciones en hielo. Coloque una parapelícula de laboratorio estirada en una placa de cultivo celular de 35 por 10 milímetros y agregue un microlitro de PBS estéril a la parapelícula.
Conecte una micropipeta de vidrio preparada a un inyector automático Pico. Presione el modo de llenado para llenar el PBS en una micropipeta y luego presione el modo de inyección para probar el microlitro de líquido asignado. Coloque una segunda pieza de parafilm de laboratorio estirado en una nueva placa de cultivo celular y agregue un microlitro de material viral teñido de verde rápido a la película.
Baje la punta de la micropipeta en el material viral y presione el modo de llenado para llenar la micropipeta con un microlitro de material viral. Bajo un microscopio de disección, baje la micropipeta llena conectada a un inyector automático en la región objetivo de la lente del embrión de pollo. A continuación, ajuste la fuente de luz para proporcionar una visión clara de la vesícula del cristalino.
Después de asegurarse de que la micropipeta está dentro de la ubicación correcta dentro del lumen de la lente, inyecte de cinco a 40 nanolitros del material viral. Después de la inyección, espere 45 segundos antes de retirar suavemente la micropipeta. A continuación, compruebe el éxito de la microinyección examinando el tinte verde rápido en el lumen vacío de la lente sin fugas.
Después del examen, selle la abertura de la cáscara de huevo con cinta adhesiva y coloque los huevos en una incubadora estática humidificada a 37 grados centígrados. Este estudio demuestra la evaluación histológica de los bucles quiméricos de conexión 50 y 43 mediante inmunofluorescencia. Utilizando el marcaje Anti-Flag, se distinguieron las conexiones exógenas de las endógenas.
El estudio también evalúa la interacción entre el dominio del bucle intracelular de la conexión 50 y la acuaporina cero.
