Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri tarafından desteklenmiştir: RO1 EY012085 (JXJ'ye) ve F32DK134051 (FMA'ya) ve Welch Vakfı hibesi: AQ-1507 (JXJ'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Figürler kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliği'nin Uygulama Yönetmeliği'ne uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Protokole genel bir bakış için bkz. Şekil 1; Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel taslak. 1 . Protokolün ilk adımı, spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesi, ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanması ve DNA fragmanı üretimidir. 2 . Gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile retroviral bir vektöre klonlanması, 3. ardından bir viral vektör . 4 . Hasat ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak yüksek titreli viral partiküllerin hazırlanması. 5 . Son adım ve bu protokolün odak noktası, RCAS (A) viral partiküllerinin lens lümenine tavuk lensi mikroenjeksiyonudur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Yüksek titreli rekombinant retrovirüslerin hazırlanması
<ol><li>Hedef protein DNA fragmanları yapmak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) NOT: Bu bölüm, hedef lens proteinine karşılık gelen DNA dizisini amplifiye etmeyi amaçlamaktadır. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.<ol><li>Bir FLAG epitop dizisi (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), bir durdurma kodonu ve bir kısıtlama enzim bölgesi (yani, Eco RI) CLa12NCO'nun polilinker bölgesinde bulunan veya bulunmayan) çerçeve içinde karboksil terminalleri ile çerçeve içinde DNA fragmanları yapmak için ilgilenilen proteine karşılık gelen PCR için primerler tasarlayın, yeterli kısıtlama enzimleri için dizilerle 1, 7,8,10,11.</li>
		<li>PCR reaksiyonunu gerçekleştirin10. Tasarlanan primerlerin 100 pmol duyu ve antianlamını 0.5 μg connexin cDNA (Cx50, Cx43 veya kimerik Cx50 * 43L kombinasyonları gibi) ile tercih edilen PCR reaksiyon tamponuna birleştirin. Her biri 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 58 °C ve 1 dakika boyunca 72 °C'den oluşan 30 döngü gerçekleştirin ve ardından 72 °C'de 10 dakika son bir uzatma yapın.</li>
		<li>PCR ürünlerini bir jel saflaştırma kiti ile izole edin ve saflaştırın.</li>
		<li>Saflaştırılmış PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre tercih edilen kısıtlama enzimlerini kullanarak sindirin.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA eklerinin adaptör plazmidine klonlanması NOT: DNA parçalarının bir adaptör vektörüne eklenmesi, RCAS(A) vektör stabilitesini artırmak için yardımcı hücrelere/virüslere olan ihtiyacı ortadan kaldırır14. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.<ol><li>Yapışkan uçlu bir ligasyon reaksiyonu kullanarak DNA parçalarını bir adaptör plazmidi olan Cla12NCO'ya alt klonlayın. PCR fragmanlarını restriksiyon enzimleri ve Cla12NCO ile 2-5:1 oranında karıştırın. Yetkili hücreleri kullanarak ligasyon ve DNA dönüşümü gerçekleştirin.</li>
		<li>Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.</li>
		<li>Doğruluğu sağlamak için DNA'yı sıralayın.</li>
	</ol></li>
	<li>RCAS(A) viral vektörüne klonlama NOT: DNA fragmanları, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere bir genin stabil transdüksiyonu için bir araca (RCAS(A) retrovirüs) yerleştirilir14,15. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.<ol><li>İlgilenilen vektörün Cla12NCO-DNA fragmanını ClaI (1 μg DNA başına 1 birim) ile sindirin ve fragmanları jel ile izole edin.</li>
		<li>DNA parçalarını ClaI-doğrusallaştırılmış bir RCAS(A) plazmidine alt klonlayın. RCAS(A) plazmidindeki ClaI bölgesini ayırt etmek için kısıtlama enzimi SalI'yi kullanın.</li>
		<li>ClaI ve SalI kısıtlama enzimleri ile sindirim yoluyla yapılara eklenen parçaların doğru yönünü onaylayın.</li>
		<li>Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.</li>
		<li>DNA konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Civciv embriyonik fibroblast (CEF) hücrelerinin transfeksiyonu ve RCAS(A) hasadı NOT: Virüs paketleme hücreleri, CEF'ler, viral partiküller içeren hücre kültürü ortamını elde etmek/hasat etmek için kullanılır15,16. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon ajanını kullanarak rekombinant retroviral DNA yapılarına sahip CEF hücrelerini transfekte edin.</li>
		<li>İlgilenilen proteinin ekspresyonunu incelemek için transfekte edilmiş hücrelerin batı blotlamasını gerçekleştirin.</li>
		<li>Transfekte edilen hücreler birleştiğinde, süpernatan ortamı toplamaya, uygun şekilde işlemeye / filtrelemeye (0.22μm filtre kullanarak herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için) başlayın ve konsantrasyona hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Viral stokların konsantrasyonu ve titresi NOT: Viral partikülleri içeren hücrelerden elde edilen pelet ve büyük hacimli ortamlar filtrelenmelidir. Ek olarak, virüsün konakçı hücrelere karşı gücünü belirlemek için bir viral titre testi yapılmalıdır. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8,15'e bakın.<ol><li>Virionları içeren kültür ortamını çözün.</li>
		<li>Kültür ortamını 4 °C'de 2 saat boyunca 72.000 × g'da döndürün.</li>
		<li>Süpernatanı boşaltın ve viral peleti artık (~50 μL) ortam ile yeniden süspanse edin ve kullanıma kadar -80 °C'de ~10 μL viral stoklarda saklayın.</li>
		<li>Titre için, QT-6 veya CEF hücrelerini kullanarak, hücreleri viral stokların seri seyreltilmesiyle transfekte edin.</li>
		<li>Birleşme sonrası,% 4 formaldehit kullanarak hücreleri sabitleyin.</li>
		<li>Mililitre başına (koloni oluşturan birimler) CFU (CFU/mL) olarak tanımlanan titreyi elde etmek için viral gag proteinleri için immün boyama veya histokimyasal olarak alkalin fosfataz için işlem.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg"> Şekil 2: Civciv lens mikroenjeksiyonu için aletler ve kurulum . (A) P-30 manuel dikey mikroelektrot mikropipet çektirmesi. (1) bir cam mikropipetin çekildiğini gösteren iç kısım. (b) (2) yumurta kuluçka makinesi. Retrovirüs enjeksiyonu için 18. aşamaya (kapalı, boş bir merkezi lümen ile) ulaşmak için tavuk yumurtasını 37 ° C'lik bir inkübatörde ~ 65-68 saat kuluçkaya yatırın. (C) Mikroenjeksiyon kurulumu. (3) aydınlatma ekipmanı, (4) Pico-Enjektör, (5) diseksiyon mikroskobu, (6) Drummond mikromanipülatörü, (7) görselleştirme için bilgisayar/kamera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Civciv lens mikroenjeksiyonu
<ol><li>Malzemelerin hazırlanması<ol><li>Mikroenjeksiyon için cam mikropipetlerin hazırlanması17 NOT: Cam kılcal damarlar, mikroenjeksiyon için uç noktası ve ~11 μm dış çapa (OD) sahip cam mikropipetler yapmak için kullanılır. Kurulum Şekil 2A'da gösterilmiştir.<ol><li>Borosilikat cam kılcalını, manuel dikey mikropipet çekicisindeki kauçuk yastıklı klipslere takın.</li>
			<li>Isı sıcaklığını (HEAT 1) 950 °C'ye ayarlayın ve daha ince ve yumuşak bir cam kılcal damar elde etmek için ön çekme işlemi gerçekleştirin.</li>
			<li>Isı sıcaklığını (HEAT 2) 790 °C'ye ayarlayın ve son mikropipetleri üretmek için ikincil bir çekme işlemi gerçekleştirin.</li>
			<li>Bir mikropipet öğütücü ile uç açıklığını ~11 μm'lik bir dış çapa kadar keskinleştirin.</li>
			<li>Gelecekteki deneyler için, cam mikropipetleri bir cam kavanozun içindeki sünger sıkıştırma pedinde saklayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Döllenmiş yumurtaların gelişme aşamasına kadar kuluçka 18 NOT: Lens gelişimi sırasında, embriyonik gelişimin ~ 65-68 saatinde, lens ektodermden ayrılır ve merkezi lümenli kapalı bir vezikül oluşturur; Proliferatif lens hücrelerinesınırlı ekspresyon için bu boş lens lümen asallarına enjeksiyon 7,8,18.<ol><li>Döllenmiş tavuk yumurtalarını 37 °C nemlendirilmiş sallanan inkübatörde ~65-68 saat kuluçkaya yatırın (Şekil 2B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Tavuk yumurtasının açılması NOT: Bu adım, embriyonun mikroenjeksiyon için tanımlanmasını ve maruz kalmasını açıklar. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.<ol><li>Çalışma alanını %70 etanol ile iyice silin.</li>
		<li>Yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın, üzerlerine %70 etanol püskürtün ve kurumaya bırakın.</li>
		<li>Yumurtayı, yumurtanın büyük ucu yukarı bakacak şekilde bir yumurta tutucusuna yerleştirin.</li>
		<li>Bir çift keskin dişli forseps kullanarak, yumurta kabuğuna dikkatlice vurarak ve yumurta kabuğunun parçalarını çıkararak yumurtanın büyük ucunda ~2 cm çapında bir delik açın (Şekil 3A).</li>
		<li>Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak embriyoyu bulun.</li>
		<li>Embriyo ve civciv merceği yerleştirildikten sonra, embriyonun üstünü hemen kaplayan amniyonik zarı kesmek için diseksiyon mikroskobu ve ince diseksiyon forseps ve makas kullanın (Şekil 3B). NOT: Çok geniş kesmeyin (sadece embriyoyu ~ 0,5 cm x 0,5 cm açığa çıkaracak kadar), aksi takdirde embriyolar yumurta sarısı kütlesine batabilir; Ayrıca mümkünse kan damarlarına dokunmaktan kaçının.</li>
		<li>Sonraki adımlara hazırlanmak için yumurtanın ağzını 60 mm'lik bir Petri kabı ile örtün.</li>
	</ol></li>
	<li>Konsantre viral stoğun mikroenjeksiyonu NOT: Transdüksiyon için hedef protein DNA fragmanları içeren viral partiküller, lens lümeninin içindeki hücrelere yerleştirilir. Kurulum Şekil 2C'de gösterilmiştir. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8'e bakın.<ol><li>Viral stok stoklarını buz üzerinde çözün.</li>
		<li>Enjeksiyon sırasında viral stoğun görselleştirilmesi için, 1 μL 10x Fast green'i 10 μL içeren bir viral stok şişesine seyreltin.</li>
		<li>Cam mikropipeti tıkayabilecek büyük çözünmemiş malzeme parçaları olmadığından emin olmak için, çözeltileri buz üzerinde tutarken "büyük parçaları" peletlemek ve süpernatanları yeni tüplere aktarmak için çözeltileri 4 °C'de 10.000 × g'da 10 saniye santrifüjleyin.</li>
		<li>35 mm x 10 mm'lik bir kültür kabına, gerilmiş bir laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL steril salin (PBS) ekleyin (sterilize edilmemiş, kapalı tarafı "temiz" olarak kabul edilir).</li>
		<li>Hazırlanmış bir cam mikropipeti otomatik bir piko-enjektöre bağlayın.</li>
		<li>Steril salini (PBS) bir cam mikropipete doldurmak için doldurma moduna basın ve ardından tahsis edilen 1 μL sıvıyı test etmek için enjeksiyon modunu kullanın.</li>
		<li>Yeni bir 35 mm x 10 mm hücre kültürü kabının yüzeyine ikinci bir gerilmiş laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL Hızlı yeşil lekeli viral stok ekleyin.</li>
		<li>Mikropipetin ucunu viral kuyruğa indirin ve cam mikropipeti ~1 μL viral stokla doldurmak için doldurma modeline basın. NOT: Kurumasını önlemek için, prosedürde bir duraklama olduğunda doldurulmuş mikropipetin ucunu steril salin (PBS) içine koyun.</li>
		<li>Otomatik enjektöre bağlı dolu cam mikropipeti, diseksiyon mikroskobu yardımıyla embriyo lens lümeninin hedef bölgesine indirin.</li>
		<li>Lens vezikülünün ana hatlarının net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için ışık kaynağını ayarlayın. NOT: Sağ merceğin lümeni (yukarı bakacak şekilde) tipik olarak enjeksiyon için kullanılır ve sol (aşağı bakacak şekilde) kontralateral kontrol olarak bozulmadan tutulur.</li>
		<li>Mikropipetin yerleştirilmesinin lens lümeni içinde doğru yerde olduğundan emin olduktan sonra, viral stoğun 5-40 nL'sini enjekte edin (Şekil 3C). NOT: Optimal enjeksiyon yerleşimi için pratik yapmak çok gereklidir.</li>
		<li>~45 saniye bekleyin ve ardından cam mikropipeti yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Lensin boş lümeninde herhangi bir sızıntı olmadan kalması gereken Fast Green boyayı inceleyerek diseksiyon mikroskobu kullanarak lens lümenine başarılı mikroenjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Enjeksiyon işleminden sonra yumurta kabuğu açıklığını bantla kapatın.</li>
		<li>Lens diseksiyonu için istenen embriyonik yaşa ulaşılana kadar embriyoyu herhangi bir dönme hareketi olmadan 37 °C nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg"> Şekil 3: Mikroenjeksiyon civciv hazırlığı ve şeması . (A) Tavuk yumurtasının açılması. (B) Amniyotik membranın kesilmesi. (C) Tavuk lens lümen mikroenjeksiyon şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tavuk Lensi Gelişimi Sırasında Protein Ekspresyonunun İncelenmesi

<ol>
	<li>Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+potent+embryonic+chick+lens+model+for+studying+congenital+cataracts+in+vivo.">Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo.</a> Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-Crystallins+of+the+chicken+lens:+remnants+of+an+ancient+vertebrate+gene+family+in+birds.">&#947;-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds.</a> The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).</li><li>Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+development.+I.+Role+of+the+lens+in+eye+growth.">Lens development. I. Role of the lens in eye growth.</a> Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).</li><li>McKeehan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+portions+of+the+chick+lens+without+contact+with+the+optic+cup.">Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup.</a> The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).</li><li>Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+effect+of+BAFF+on+chicken+B+cell+development+revealed+by+RCAS+retroviral+gene+transfer+in+vivo.">Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo.</a> Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).</li><li>Fekete, D. M., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+retroviral+vectors+encoding+alkaline+phosphatase+reveal+spatial+restriction+of+viral+gene+expression/transduction+in+the+chick+embryo.">Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).</li><li>Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+retroviruses+to+express+connexins.">Use of retroviruses to express connexins.</a> Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).</li><li>Jiang, J. X., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+expression+of+connexins+in+embryonic+chick+lens.">Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).</li><li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+autofluorescent+proteins+reveals+a+novel+protein+permeable+pathway+between+cells+in+the+lens+core.">Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core.</a> Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).</li><li>Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+enhances+gap+junction+coupling+via+its+cell+adhesion+function+and+interaction+with+connexin+50.">Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50.</a> Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+extracellular+domain+of+connexin+50+is+important+for+in+cell+adhesion,+lens+differentiation,+and+adhesion+molecule+expression.">The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).</li><li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+gene+expression+and+protein+targeting+in+lens+fiber+cells.">Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).</li><li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organization+of+primary+lens+fiber+cells.">Three-dimensional organization of primary lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).</li><li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors.">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li><li>Yan, R. T., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+RCAS+retrovirus.">Production of high-titer RCAS retrovirus.</a> Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).</li><li>Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+mammalian+cells.">Introduction of DNA into mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+macrophage+activation+in+immune-privileged+lens+through+CSF-1+protein+intravitreal+injection+in+mouse+model.">Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+regulatory+status+of+food,+drug+and+cosmetics+colour+additives+exempt+from+certification.">The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification.</a> Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).</li><li>Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+differentiation+by+chicken+lens+epithelium+in+in+vitro+cell+culture.">The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomicrographic+evaluation+of+drug-induced+cataracts+in+cultured+embryonic+chick+lens.">Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens.</a> Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).</li><li>Musil, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+embryonic+chick+lens+cells+as+a+model+system+to+study+lens+gap+junctions+and+fiber+cell+differentiation.">Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).</li><li>West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis.">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li><li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response.">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501 (2023).</li><li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification.">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li><li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens.">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li></ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.

Bu deneysel model, bozulmamış mercekte ilgilenilen protein(ler)i ifade etme fırsatı sunar ve bu proteinlerin mercek yapısı ve işlevindeki işlevsel öneminin incelenmesine yol açar. Embriyonik civciv mikroenjeksiyon modeli kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et tarafından daha da geliştirildi. al.8 ve hem viral plazmitleri hem de agonistler, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ve peptitler gibi ajanlarıcivcivlerin merceğine 1,9,10,11,12,1...

Bu protokolün amacı, bir RCAS(A)'nın (replikasyona yetkin kuş sarkomu/lökoz retrovirüsü A) embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini tanımlamaktır. Embriyonik bir tavuk merceğinde etkili retroviral uygulamanın, normal mercek fizyolojisi, patolojik koşullar ve gelişiminde mercek proteinlerinin moleküler mekanizması ve yapı-işlevinin in vivo çalışması için umut verici bir araç olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu deneysel model, terapötik hedeflerin tanımlanması ve insan konjenital kataraktları gibi durumlar için ilaç taraması için kullanılabilir. Toplamda, bu protokol, lens proteinlerinin incelenmesi için özelleştirilebilir bir platformun geliştirilmesi için gerekli adımları ortaya koymayı amaçlamaktadır.
Embriyonik civcivler (Gallus domesticus), lens yapısı ve insan merceği ile işlev bakımından benzerlikleri nedeniyle, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir 1,2,3,4. RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanımı, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem olarak kabul edilmiştir. Özellikle, boş lens lümeninin varlığının proliferatif lens fiber hücreleri içinde eksojen proteinlerin ekspresyonu için kısıtlı bölgeye yerinde RCAS (A) mikroenjeksiyonuna izin verdiği benzersiz embriyonik gelişim zaman çerçevesini kullanarak, dokuya özgü proliferatif lens lifi hücrelerine ihtiyaç duymadan hedef gen transferini proliferatif lens lifi hücrelerine sınırlamak için benzersiz bir yeteneğesahiptir 5, 6,7,8.
Burada derinlemesine açıklanan civciv embriyo mikroenjeksiyon prosedürü, başlangıçta kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et. al.8 ve hem viral hem de viral olmayan plazmitleri embriyonik civcivlerinmerceğine sokmanın bir yolu olarak kullanılmıştır 1,9,10,11,12,13. Genel olarak, önceki çalışma, lens gelişimini, farklılaşmasını, hücresel iletişimi ve hastalığın ilerlemesini incelemek ve katarakt gibi lens patolojik durumları için terapötik hedeflerin keşfi ve test edilmesi için bu metodolojiyi kullanma potansiyelini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>For removing cellular debris from media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Culture Dish</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>50-202-030</td>
			<td>For using during microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>Spinning down solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constructs</td>
			<td>GENEWIZ</td>
			<td>-</td>
			<td>For generation of constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-4TZ-144A</td>
			<td>Visualization of lens for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Generation of primers: 
			 
			Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1&#8211;97 and 149&#8211;400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC 
			 
			ILs of Cx43 (residues 98&#8211;150) and Cx46 (residues 98&#8211;166) were&#160; obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively 
			 
			Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC 
			 
			ILs of Cx50 (residues 98&#8211;148) or Cx46 (residues 98&#8211;166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjection Pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>LED-50WY</td>
			<td>Lighting for visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Holder</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Incubator</td>
			<td>GQF Manufacturing Company Inc.</td>
			<td>1502</td>
			<td>For incubation of fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>F99-10</td>
			<td>For visualization of viral stock injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Texas A&#38;M University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-095-003</td>
			<td>For anti-FLAG&#160; 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td>For moving things around and isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual vertical micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td>To obtain glass micropipette of the correct size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-682-004</td>
			<td>Dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td>For imaging staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>03-448-254</td>
			<td>Placing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Injector</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PLI-100</td>
			<td>For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-chick AQP0</td>
			<td>Self generated</td>
			<td>-</td>
			<td>Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-FLAG antibody</td>
			<td>Rockland Immunichemicals</td>
			<td>600-401-383</td>
			<td>For staining FLAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-295-003</td>
			<td>For anti-AQP0&#160; 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge clamping pad</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BX10</td>
			<td>For storage of glass micropipette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of recombinant rcas(a) retrovirus into embryonic chicken lens

Embriyonik tavuk (Gallus domesticus), insan merceği ile yüksek derecede benzerliği göz önüne alındığında, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir. RCAS(A), erken gelişim aşamalarında lens vezikülünün boş lümenine mikroenjeksiyon yoluyla lens gelişimi sırasında vahşi tip ve mutant proteinlerin in situ ekspresyonunu ve işlevini incelemek için güçlü bir araç görevi gören, bölünen hücreleri enfekte eden, replikasyona yetkin bir tavuk retrovirüsüdür. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanılması, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sağlar. Spesifik olarak, hedeflenen gen transferi, dokuya özgü promotörlere ihtiyaç duymadan proliferatif lens lifi hücreleriyle sınırlandırılabilir. Bu yazıda, rekombinant retrovirüs RCAS(A) hazırlığı için gereken adımları kısaca gözden geçireceğiz, mikroenjeksiyon prosedürüne ayrıntılı, kapsamlı bir genel bakış sunacağız ve tekniğin örnek sonuçlarını sunacağız.

The goal of this protocol is to describe the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) (replication-competent avian sarcoma/leukosis retrovirus A). Effective retroviral delivery in an embryonic chicken lens has been demonstrated to be a promising tool for the in vivo study of the molecular mechanism and structure-function of lens proteins in normal lens physiology, pathological conditions, and development. Moreover, this experimental model could be used for the identification of therapeutic targets and drug screening for conditions such as human congenital cataracts. In all, this protocol aims to lay out the necessary steps for the development of a customizable platform for the study of lens proteins.
Embryonic chicks (Gallus domesticus), owing to their similarity in lens structure and function with the human lens, are a well-established animal model for the study of lens development and physiology1,2,3,4. The use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus has been regarded as a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Notably, it has a unique ability to confine the target gene transfer to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters, using the unique embryonic development time frame in which the presence of empty lens lumen permits in situ RCAS(A) microinjection into the restricted site for the expression of exogenous proteins within proliferative lens fiber cells5,6,7,8.
The chick embryo microinjection procedure, described in-depth here, is based originally partially on the work of Fekete et. al.6 and further developed by Jiang et. al.8 and has been utilized as a means of introducing both viral and nonviral plasmids into the lens of embryonic chicks1,9,10,11,12,13. Overall, the previous work demonstrates the potential of utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Yazar Gündemi: Embriyonik Tavuk Lensinde RCAS(A) Retrovirüsünün Mikroenjeksiyonu Yoluyla Lens Gelişimi ve İşlevinin Araştırılması 

Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

The presented methodology of embryonic chicken lens microinjection of a RCAS retrovirus is meant as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the RCAS replication-competent avian retrovirus provides a highly-effective, rapid, and customizable system for expressing exogenous proteins in chick embryos. Targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for promoters.There is prominent potential for utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesinden ve ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanmasından sonra, genel deneysel yaklaşım, gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile bir retroviral RCAS(A) vektörüne klonlanmasını ve ardından bir viral vektörü içerir. İkincisi, yüksek titreli viral partiküller, viryonları hasat etmek ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak hazırlanır. Bu ilk iki ana adım büyük ölçüde tanımlanmış ve temsili sonuçlar başka yerlerde<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCASA Retrovirus in Embryonic Chicken Lens at JoVE.com

Bu protokol belgesi, lens gelişimi sırasında in situ fonksiyon ve proteinlerin ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak bir RCAS(A) retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini açıklamaktadır.

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Bir RCAS retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun sunulan metodolojisi, lens gelişimi sırasında proteinlerin in situ fonksiyonunu ve ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS replikasyonuna yetkin kuş retrovirüsü, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sağlar. Hedeflenen gen transferi, promotörlere ihtiyaç duymadan proliferatif lens lifi hücreleriyle sınırlandırılabilir.Lens gelişimini, farklılaşmasını, hücresel iletişimi ve hastalığın ilerlemesini incelemek ve katarakt gibi lens patolojik durumları için terapötik hedeflerin keşfi ve test edilmesi için bu metodolojiyi kullanmak için önemli bir potansiyel vardır.

microinjection-recombinant-rcasa-retrovirus-into-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

700 Görüntüleme.  University of Texas Health Science Center, San Antonio. Bir RCAS retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun sunulan metodolojisi, lens gelişimi sırasında proteinlerin in situ fonksiyonunu ve ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS replikasyonuna yetkin kuş retrovirüsü, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sa?...

Video: Yazar Gündemi: Embriyonik Tavuk Lensinde RCAS(A) Retrovirüsünün Mikroenjeksiyonu Yoluyla Lens Gelişimi ve İşlevinin Araştırılması 

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Biyoloji

Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus

To begin, attach the borosilicate glass capillary to the rubber cushioned clips in the manual vertical micropipette puller. Set the heat temperature of the micropipette puller to 950 degrees Celsius and perform pre-pulling to obtain a thinner and softer glass capillary. Then set the heat temperature to 790 degrees Celsius and perform a secondary pulling to produce final micropipettes.Using a micropipette grinder, carefully sharpen the tip opening to an outer diameter of 11 micrometers. Then place the micropipettes in a sponge clamping pad inside of a glass jar. Incubate the fertilized chicken eggs until development stage 18 in a 37 degree Celsius humidified rocking incubator.Wipe down the working area thoroughly with 70%ethanol. After development, remove the eggs from the incubator. Spray the eggs with 70%ethanol and allow them to air dry.Then place the egg on an egg holder with the larger end facing upwards. Using a pair of sharp toothed forceps, carefully tap on the larger end of the eggshell to create a two centimeter diameter hole. Then remove the fragments of the egg shell.Place the egg on a dissecting microscope stage and locate the embryo. Next, use the fine dissecting forceps and scissors to cut off the amniotic membrane covering the top of the embryo. Then place a 60 millimeter Petri dish over the opening of the egg.

Bir RCAS(A) Retrovirüsünün Mikroenjeksiyonu için Tavuk Lensinin Hazırlanması

Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins 

To begin, thaw the RCAS(A)retrovirus stock on ice. To avoid clogging the micropipette, centrifuge the solution at 10, 000 G for 10 seconds at four degrees Celsius and transfer the supernatant into a new tube while keeping the solutions on ice. Place a stretched laboratory parafilm on a 35 by 10 millimeter cell culture dish and add one microliter of sterile PBS to the parafilm.Connect a prepared glass micropipette to an automatic Pico injector. Press the fill mode to fill the PBS into a micropipette and then press the inject mode to test the allocated one microliter of liquid. Place a second piece of stretched laboratory parafilm on a new cell culture dish and add one microliter of fast green stained viral stock to the film.Lower the tip of the micropipette into the viral stock, and press the fill mode to fill the micropipette with one microliter of viral stock. Under a dissecting microscope, lower the filled micropipette connected to an automatic injector into the target region of the chicken embryo lens. Then adjust the light source to provide a clear view of the lens vesicle.After ensuring the micropipette is within the correct location inside the lens lumen, inject five to 40 nanoliters of the viral stock. After injection, wait 45 seconds before gently removing the micropipette. Next, check the successful microinjection by examining the fast green dye in the empty lumen of the lens without an leakage.Following examination, seal the eggshell opening with scotch tape and place the eggs in a 37 degree Celsius humidified static incubator. This study demonstrates the histological evaluation of the chimeric connexon 50 and 43 loops through immunofluorescence. Using Anti-Flag labeling, exogenous connexons were distinguished from endogenous ones.The study also evaluates the interaction between the intracellular loop domain of connexon 50 and Aquaporin zero.