Para comenzar, coloque el reactivo de disociación celular HBSS EGM-2 y DMEM en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Descongele la trombina y la laminina durante la noche a 4 grados centígrados y el fibrinógeno a temperatura ambiente. Agregue 1,5 microlitros de trombina en un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros.
Coloque placas de alto rendimiento esterilizadas por UV en un desecador durante 30 minutos para eliminar el aire atrapado en la microfluídica. Coloque el matraz T75 bajo el microscopio con un aumento de 4x para confirmar la confluencia celular y la eficiencia de la transducción. Lave las células dos veces con cinco mililitros de HBSS.
A continuación, añadir un mililitro de reactivo de disociación al matraz e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante uno o dos minutos. Golpee suavemente el matraz con la palma de la mano y observe bajo el microscopio que se han levantado todas las células. Lave las células con nueve mililitros de medios apropiados y recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros.
Retire inmediatamente una pequeña alícuota y cuente las celdas. Centrifugar la suspensión celular a 300 G y cuatro grados centígrados durante tres a cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio adecuado sobre hielo.
Usando la ecuación dada, calcule el número de celdas necesarias. Vuelva a suspender las células a una concentración de 1 por 10 a 6 células por mililitro y calcule el volumen de células necesario utilizando la siguiente ecuación. Centrifugar el volumen requerido de suspensión celular como se demuestra.
Luego, en un volumen calculado de fibrinógeno, vuelva a suspender el gránulo en hielo.
