Este protocolo se puede utilizar para crear xenoinjertos derivados del paciente que recapitulan la histopatología de malformaciones venosas. Esto se permitió además para llevar nuestras pruebas terapéuticas preclínicas. Esta técnica proporciona un sistema NVivo rápido y fiable que permite el seguimiento diario del crecimiento de las células endoteliales directas del paciente y la respuesta a la terapia experimental.
Este método podría adaptarse fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares o linfáticas. Comience preparando la suspensión celular para inyección. Pruebe las células endoteliales con cinco mililitros de 0.05%tripsin-EDTA precalentados a 37 grados Celsius durante dos minutos.
Neutralizar los tripsina y añadiendo cinco mililitros de EGM y recoger las células en tubo cónico de 150 mililitros. Centrifugarlo a 400 veces G durante cinco minutos y luego aspirar el sobrenadante y resuspend las células en tres mililitros de EGM. Cuente las células con un hemocicómetro.
Ate la cantidad de volumen con el número de celda deseado en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y pelete las células de nuevo por centrifugación. Aspirar el sobrenadante dejando un pequeño volumen para aflojar el pellet celular. Resuspender el pellet celular con 220 microlitros de BMEM por inyección.
Mezcle bien la suspensión celular sobre hielo asegurándose de evitar la creación de burbujas. Aspirar la mezcla de cultivo celular BMEM en una abertura de jeringa de un mililitro tirando del émbolo. Encerrará una aguja estéril de calibre 26 en la jeringa y mantendrá las jeringas preparadas sobre hielo antes de la inyección.
Después de asegurarse de que el ratón ha anestesiado correctamente colocarlo en su estómago y desinfectar la región de inyección con 70%etanol. Enrolle suavemente la jeringa preparada para resuspender las células asentadas. Burbujas de escamas hasta el final de la jeringa y expulsar un pequeño volumen de la suspensión celular.
Pinche la piel en el lugar de inyección para crear una tienda de campaña como estructura. A continuación, inserte la aguja justo debajo de la piel y asegúrese de que la aguja sólo es la piel profunda mediante la liberación de pellizcar la piel para evitar la inyección en el tejido muscular. Sostenga la aguja constantemente inyectando cuidadosamente 200 microlitros de la suspensión celular para crear una pequeña masa esférica.
Tenga cuidado de evitar inyectar la suspensión celular en el músculo. Mida la longitud y la anchura de cada enchufe con una pinza. Alinee los tapones de xenoinjerto diseccionados en una tabla de cortar junto a una regla y tome una imagen para registrar la vascularización bruta de las lesiones.
A continuación, fije los enchufes sumergiéndolos en 10% de formol durante la noche a temperatura ambiente. Después de la disección, los tapones de la lesión se procesan para el análisis histológico y se tiñen de UEA-1 para detectar células endoteliales derivadas humanas dentro del tapón. Tome cinco imágenes HPF por sección de lesión con un microscopio de campo brillante a 20 X de aumento en un patrón de plano X dentro de la sección de la lesión para evitar la superposición.
Asegúrese de incluir una barra de escala en las imágenes tomadas. Abra las imágenes HPF en la imagen J.To calibrar los píxeles de la barra de escala, utilice la herramienta de línea recta y pase por encima de la barra de escala. A continuación, convierta los píxeles medidos en milímetros haciendo clic en Analizar y Establecer escala.
A continuación, haga clic en Analizar definir medidas y seleccione el área y agregue a la superposición. Mida el área de campo total del HPF utilizando analizar y medir el ahorro de esta medición para la cuantificación. Usando la herramienta de selección de manos libres perfilar manualmente el canal vascular positivo UEA-1.
Haga clic en Analizar y medir para cuantificar el área esbozada. Mida todos los canales vasculares dentro del HPF. Repita el proceso para los cinco HPF tomados dentro de cada sección y transfiera los valores a Excel para su posterior análisis.
A continuación, calcule el porcentaje de área vascular y densidad vascular de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Usando este protocolo, los tapones de lesiones con células endoteliales mutantes hiperactivas TIE2 o PIK3CA se vascularizan visiblemente y se perfunden dentro de los siete a nueve días después de la inyección. Los tapones de la lesión se asemejan mucho a las características histopatológicas del tejido humano VM y son visibles los grandes canales vasculares alineados por una fina capa de células endoteliales.
Estas estructuras vasculares suelen contener eritrocitos que confirman la anastomosis funcional con la vasculatura del ratón huésped. La tinción inmunohistoquímica utilizando la lectina específica humana UEA-1 confirma que las células que recubren las regiones vasculares se derivan de células implantadas humanas en lugar de vasculatura de ratón. Después de este procedimiento, se puede realizar una tinción adicional de las secciones de la lesión para marcadores de proliferación o apoptosis para analizar los efectos específicos de los tratamientos experimentales.
Este modelo escenográfico se ha utilizado para estudios preclínicos de nuevas terapias para la malformación venosa, como la rapamicina inhibidora de mTOR, que ha demostrado eficacia en varios ensayos clínicos para pacientes con VM.
