Para empezar, tome un tubo con organoides derivados del paciente o suspensión de PDO en una cantidad igual de extractos de membrana basal o BME. Con una pipeta de 20 microlitros, siembre cinco cúpulas de microlitros en el centro de cada pocillo de una placa de 96 pocillos precalentada. Después de sembrar todos los pozos, coloque la tapa en el plato e inviértala suavemente.
Incubar la placa invertida a 37 grados centígrados durante 20 minutos en la incubadora de cultivo de tejidos para permitir que las cúpulas se solidifiquen. Dale la vuelta al plato para que la tapa quede hacia arriba. A continuación, vuelva a incubar.
Después de añadir colorantes fluorescentes y fármacos a las placas que contienen las PDO. Coloque la placa en la cita cinco. Inicie el software Gen5 y, en la ventana del administrador de tareas, seleccione el modo manual del generador de imágenes y haga clic en capturar ahora.
En la configuración, especifique el objetivo, el filtro, el formato de la microplaca y el tipo de recipiente, seleccione usar tapa y usar velocidad de portadora más lenta y haga clic en Aceptar. A continuación, elija un pozo de interés. Seleccione el canal de campo claro, haga clic en exposición automática y ajuste la configuración según sea necesario.
A continuación, para configurar la pila Z, expanda la pestaña del modo de imagen, seleccione Pila Z y ajuste el enfoque con las flechas de ajuste de rumbo hasta que todos los PDO estén desenfocados. Establezca este punto como la parte inferior de la pila Z y repita a la inversa para establecer la parte superior. Después, configure los canales fluorescentes abriendo el paso de edición de imágenes.
En canales, seleccione el número deseado de canales, designe un canal para el campo claro y canales adicionales para cada canal fluorescente. Cierre la ventana haciendo clic en Aceptar, cambie el menú desplegable a GFP para establecer la exposición para el primer canal fluorescente, haga clic en exposición automática y ajuste la configuración de exposición en la pestaña Exposición para reducir la señal de fondo. Para copiar la configuración de exposición en la pestaña de modo de imagen, haga clic en el icono de copia y, a continuación, haga clic en el paso de edición de imágenes para abrir una nueva ventana.
En el canal GFP, haga clic en el icono del portapapeles en la línea de exposición para agregar ajustes de iluminación, tiempo de integración y ganancia de cámara al canal. Ahora haga clic en el icono de la cámara y elija el preprocesamiento de imágenes en el paso Agregar procesamiento. En la pestaña de campo claro, desmarque la opción Aplicar preprocesamiento de imágenes.
Para cada pestaña de canal fluorescente, asegúrese de que la opción aplicar preprocesamiento de imágenes esté marcada. Anule la selección, use las mismas opciones que el canal uno y, a continuación, haga clic en Aceptar para cerrar la ventana. Ahora haga clic en Proyección Z debajo del paso agregar procesamiento, ajuste el rango de corte si es necesario y cierre la ventana haciendo clic en Aceptar.
Para configurar el protocolo para la creación de imágenes cinéticas, en la barra de herramientas, haga clic en conjunto de imágenes y, en el menú desplegable, elija crear experimento a partir de este conjunto de imágenes. Haga clic en las opciones debajo del otro encabezado y marque la casilla de procedimiento cinético discontinuo. En Tiempo total estimado, introduzca el tiempo de ejecución del experimento.
Cierre la ventana haciendo clic en Aceptar. Además, establezca el diseño de la placa y el gradiente de temperatura en este momento. Valide los pasos de reducción de datos haciendo clic en las ventanas.
A continuación, navegue hasta el archivo y haga clic en guardar protocolo como en la barra de herramientas. Seleccione una ubicación para guardar. Introduzca un nombre de archivo y haga clic en guardar.
Para comenzar la obtención de imágenes cinéticas, cargue el protocolo en el software de programación de bio spa on demand y elija una ranura disponible. En la pestaña de información del procedimiento, seleccione usuario en el menú. Junto a la ranura de protocolo, haga clic en seleccionar y elija agregar una nueva entrada.
Ahora haga clic en seleccionar junto a la ranura de protocolo. Haga clic en abrir para navegar e importar el protocolo en el software de programación. Introduzca el tiempo de imagen requerido para la placa y haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
En intervalo, ingrese la frecuencia deseada de imágenes, seleccione el programa, la placa o el recipiente para iniciar la secuencia de validación de la placa, haga clic en sí para aceptar este programa.
