Para comenzar, abra el software y seleccione la opción para crear un nuevo archivo de ADN. Prepare la secuencia del gen PRRSV del NCBI y haga clic en Aceptar para generar los archivos de secuencia. Analice la secuencia y marque las uniones de fragmentos.
Identifique todas las uniones antes de diseñar los cebadores de secuencia específicos para los fragmentos. A continuación, haga clic en Imprimaciones y elija Añadir imprimación. Pegue la secuencia específica y agregue secuencias superpuestas del vector a los primeros cinco nucleótidos principales del cebador.
Asigne un nombre a la imprimación directa y haga clic en Agregar imprimación a la plantilla para incorporar la imprimación diseñada a la plantilla. A continuación, marque las uniones de fragmentos y diseñe el cebador de secuencia específica inversa de los fragmentos. De nuevo, vaya a Imprimaciones y seleccione Agregar imprimación.
Introduzca la secuencia específica. Agregue el sitio de restricción a los primeros cinco nucleótidos principales. Además, incluya de 20 a 40 pares de bases de secuencias de saliente vectorial hasta los primeros cinco nucleótidos principales del sitio de restricción.
Asigne un nombre al cebador inverso y seleccione Agregar imprimación a la plantilla. A continuación, configure seis reacciones individuales de PCR utilizando los seis fragmentos y los pares de cebadores diseñados. Ejecute la PCR siguiendo un protocolo de tres pasos, como se muestra aquí.
Una vez finalizada la PCR, pipetee un microlitro de seis tampones de carga de ADNx con cinco microlitros del producto de PCR. Mezclar y centrifugar brevemente. Analice las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Para construir un gen de longitud completa, se amplificaron fragmentos de PRRSV mediante seis reacciones de PCR. Los tamaños de los fragmentos se confirmaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
