Aislamiento y siembra de células madre neurales (NSC) derivadas de la zona subventricular murina para la formación de la neurosfera

Para aislar las células madre neuronales o NSC de las zonas subventriculares de las neuronas disecadas o SVZ, corte cada SVZ en cuatro o cinco piezas pequeñas para facilitar la disgregación del tejido. Con una pipeta pasteur de plástico estéril, transfiera los SVZ picados a un tubo de centrífuga de 15 mililitros asegurándose de que no queden fragmentos en la placa. Deje que el tejido se sedimente en el fondo del tubo antes de eliminar el DPBS restante.

Agregue 500 microlitros de mezcla enzimática filtrada que contenga para los dos SVZ por cerebro, e incube el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de medio de control previamente advertido a 37 grados centígrados a cada muestra. Centrifugar la muestra a 300 g durante cinco minutos.

Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta o una bomba de vacío. Con una pipeta de vidrio de pasto pulida al fuego, agregue un mililitro de medio de control al pellet. Distribuya mecánicamente el pellet cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces hasta obtener una suspensión celular homogénea.

A continuación, añadimos cuatro mililitros de medio de control, y mezclamos por inversión para lavar las células. Después de centrifugar a 300 g durante cinco minutos, vuelva a suspender homogéneamente el pellet resultante en un mililitro de medio completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Después de diluir una parte de una alícuota de la suspensión celular con una parte de azul de tripán, cuente las células usando una cámara de Neubauer bajo el microscopio.

Asegure la desagregación celular a nivel de una sola célula antes de sembrar las células por igual en ocho pocillos de una placa de 48 pocillos en un volumen final de 500 microlitros de medio completo. Incuba las células durante cinco a siete días para permitir que se formen las neuroesferas primarias.