Para realizar el paso de neuroesferas obtenidas de neurocélulas madre aisladas de la zona subventricular de las neuronas, recoja el medio que contiene las neuroesferas de las placas de pocillos múltiples y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar las neuroesferas durante cinco minutos a 300 G. Después de eliminar el sobrenadante, agregue 200 microlitros de solución enzimática al pellet y golpee suavemente el fondo del tubo para desalojarlo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para facilitar la disociación de la neurosfera.
Luego agregue un mililitro de medio de control para detener la reacción enzimática. Disocie mecánicamente las neuroesferas con una micropipeta P 1000 pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces. Añadir un volumen adicional de cuatro mililitros de medio de control y mezclar por inversión para lavar las células.
Centrifugar las células durante cinco minutos a 300 g antes de eliminar el sobrenadante. Agregue un mililitro de medio completo y vuelva a suspender el pellet para homogeneizar la suspensión celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Después de diluir una parte de una alícuota de la suspensión celular con una parte de azul de tripán, cuente la suspensión celular usando una cámara de Neubauer.
Para expandir el cultivo, siembre las células a una densidad de 10.000 células por centímetro cuadrado utilizando un medio completo en una placa o matraz de cultivo apropiado.
