Para comenzar, descargue e instale la última versión de Fiji en una computadora. Después de descargar el convert_to_TIFF. py script, arrastre y suelte el script en Fiji y ejecute el código.
Vaya a la ruta de acceso en la que se almacena el experimento. Los archivos TIFF convertidos se crean dentro de la misma carpeta experimental. Haga clic en complementos, luego en 3D Suite y abra las opciones del administrador 3D.
Dentro de la ventana del administrador 3D, seleccione las casillas de verificación correspondientes al volumen en unidad, el valor medio de gris, el cuadro delimitador en píxel, el valor de gris de desviación estándar, el centroide en píxel y el centroide en unidad. Marque la casilla Excluir objetos en los bordes XY y Excluir objetos en los bordes Z.A continuación, haga clic en Aceptar. Abra la imagen fluorescente de los linfocitos T humanos.
Haga clic en Control Shift D para duplicar el canal de proteína, incluida la pila. Marque la casilla de verificación Hyper Stack. Especifique el número de canal adecuado dentro del cuadro de canales y cámbiele el nombre correspondiente.
Para iniciar la grabadora de macros de Fiji, navegue hasta los complementos, luego a las macros y seleccione grabar. A continuación, para abrir el plugin FindFoci, haga clic secuencialmente en los plugins GDSC, FindFoci y FindFoci GUI. En el menú desplegable de la imagen, seleccione la imagen que desea analizar.
Establezca el desenfoque gaussiano en 1,5, el método de fondo en la desviación estándar por encima de la media, el parámetro de fondo en nueve, el método de búsqueda en la fracción del fondo máximo, el parámetro de búsqueda en 0,7, el método de pico en relativo por encima del fondo, el parámetro de pico en 0,2 y el tamaño mínimo en cinco. Establezca los picos máximos en números altos para incluir todos los focos de la imagen. Para mejorar la identificación de focos, ajuste el desenfoque gaussiano cerca del diámetro de los focos y aumente los valores del parámetro de fondo para imponer umbrales más estrictos.
A continuación, disminuya los valores del parámetro de búsqueda para incluir áreas más alejadas del pico de fluorescencia y disminuya los valores del parámetro de pico para la separación de picos. Ejecute FindFoci y copie la cadena que aparece en la ventana de la grabadora. La cadena contiene los parámetros seleccionados, excepto las comillas.
Después de descargar el script nuclear_prod_q. py, arrastre y suelte el script en Fiji y haga clic en ejecutar para ejecutar el código. En el canal del núcleo, introduzca el número correspondiente al canal de DAPI.
Para el desenfoque gaussiano del núcleo, introduzca el valor de sigma necesario para desenfocar la imagen para la segmentación. A continuación, introduzca el número correspondiente al canal de la tinción de interés para el canal de proteínas. En el parámetro FindFoci, pegue la cadena que representa la grabación de macros de los parámetros seleccionados.
Marque la casilla de verificación visual y haga clic en Examinar para seleccionar el directorio donde se almacenan las imágenes. Una vez que se hayan compilado todas las casillas, haga clic en Aceptar para continuar con la ejecución. En la lista de ROI de la ventana 3D del administrador de ROI, seleccione el canal de núcleos y haga clic en ROI en vivo para activar.
Selecciona el ROI que pertenezca al mismo núcleo y pulsa fusionar. Y para núcleos no deseados, presione suprimir. De nuevo, haga clic en ROI en vivo para activar, seleccionar todo y confirmar que todos los núcleos están correctamente segmentados.
Desde la carpeta de cuantificación, abra el archivo TXT con los registros de los parámetros utilizados para el análisis. Abre Google Colab en un navegador. A continuación, en el archivo, seleccione abrir cuaderno y cargue las métricas finales de proteínas nucleares.
Script ipynb. Cargue todas las carpetas que contienen los archivos CSV de cada campo de imagen en una carpeta de preferencias en Google Drive. En el bloc de notas, indique la ruta de acceso de la carpeta donde se almacenan las subcarpetas de resultados y ejecute todas las celdas.
Cuando el código haya terminado de compilarse, abra el archivo de hoja de cálculo final que contiene todos los datos compilados.
