Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health numéro de la subvention R21-01-HL094828 décerné au Dr Poelzing.

1. Préparer Fonction bruit et le signal d&#39;entrée <ol><li> Créer une fonction de bruit contenant les composants de fréquence désirée. Cela peut être fait en décrivant les composants de fréquence souhaitée dans le domaine fréquentiel puis en calculant la transformée de Fourier rapide inverse. Dans cette étude, 1 - 15 kHz a été utilisé. Toutes les transformations de Fourier et de Fourier inverse transforme décrites dans cette étude ont été calculées en utilisant la FFT de Matlab et les fonctions IFFT. </li><li> Échelle de l&#39;amplitude de la fonction de bruit de manière appropriée. Dans cette étude, la fonction de bruit a été réduit de telle sorte que le zéro à pic d&#39;amplitude de la fonction de bruit est de 50 ou 100 mV. </li><li> Créer un fichier de relance en utilisant des méthodes appropriées pour le logiciel d&#39;acquisition utilisé. Pour Clampex 8, d&#39;abord créer un fichier texte avec l&#39;en-tête approprié. Ci-dessous l&#39;en-tête, insérez l&#39;incrément de temps pour un seul balayage de la première colonne. Les incréments de temps devrait avoir le même espacement temporel que l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage utilisé dans les mesures. Pour chaque balayage dans le protocole de l&#39;échelon de tension d&#39;insérer les tensions exacte souhaitée à chaque pas de temps. Ceci devrait inclure la fonction de bruit. </li></ol> 2. Effectuer des mesures de voltage <ol><li> Créer un protocole de mesure dans le logiciel d&#39;acquisition qui est compatible avec le fichier de relance généré précédemment. En Clampex, il ya un menu qui permet à l&#39;utilisateur d&#39;associer un fichier de relance avec le protocole actuel. </li><li> Attacher un modèle (ou biologique) de cellules à l&#39;équipement de mesure. </li><li> Réaliser l&#39;expérience, comme prévu. Aux fins de contrôle, assurez-vous d&#39;inclure des mesures périodiques qui ne comprennent pas toutes les fonctions de bruit. </li></ol> 3. Analyse Expérience Message <ol><li> Calculer la courbe IV pour un enregistrement individuel. Si l&#39;enregistrement est à l&#39;état stationnaire lorsque la fonction du bruit est appliquée, la courbe IV peut être créé en utilisant une partie l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;enregistrement temporellement dehors de la plage de la fonction de bruit. Si l&#39;enregistrement n&#39;a pas été à l&#39;état stationnaire, la fonction de bruit peut interférer avec le calcul de la courbe IV, donc un deuxième enregistrement doit être fait sans la fonction de bruit présent. </li><li> Pour chaque étape de tension dans un enregistrement de calculer la transformée de Fourier rapide de la portion de l&#39;enregistrement où la fonction de bruit a été inséré. Combinez la transformée de Fourier pour chaque étape de tension en amxn matrice, où m est le nombre de fréquences dans la FFT, et n est le nombre d&#39;étapes de tension. Dans cette configuration, chaque rangée de la matrice représente l&#39;amplitude d&#39;une fréquence unique à tous les échelons de tension dans l&#39;expérience. </li><li> Pour chaque fréquence (c&#39;est à dire chaque ligne de la matrice ci-dessus) corréler la ligne avec la courbe IV généré en 3.1 et enregistrer le coefficient de corrélation. </li><li> Tracer la fréquence en fonction du coefficient de corrélation pour visualiser les fréquences dont hautement corrélée avec la courbe IV. Depuis la composante continue est contenue dans la première fréquence de la FFT, le coefficient de corrélation pour cette fréquence doit toujours être&gt; 0,99. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Des mesures représentatives de tension de serrage sont indiqués pour une cellule modèle sans (figure 1A) et avec (figure 1B) une fonction de bruit inséré dans le protocole échelon de tension. La courbe IV a également été calculée pour la cellule de modèle (figure 1C). Pour chaque balayage, dans les enregistrements de la figure 1, la FFT a été calculé sur la période où la fonction de bruit a été inséré (voir encadré rouge dans les figures 1A, 1B). Figures 2A et 2B montrent la FFT calculée pour les enregistrements de la figure 1A et 1B, respectivement. Lors de l&#39;inspection visuelle, la composante continue (en rouge) apparaît pour imiter la forme de la courbe IV. Sans la fonction de bruit, toutes les fréquences supérieures DC semblent avoir amplitudes proche de zéro (figure 2A). Lorsque la fonction de bruit est inséré, les fréquences entre 1 et 15 kHz ont des amplitudes visuellement perceptibles (figure 2B). La figure 3 montre le résultat de la corrélation des amplitudes de fréquences individuelles au cours de la série de mesures de tension contre la courbe IV. La figure 3A-C montre les coefficients de corrélation lorsque l&#39;expérience a été faite dans des conditions de contrôle (pas de fonction de bruit) et avec des amplitudes de bruit de 50 et 100 mV, respectivement. Avis à tous les cas, la composante continue semble être en corrélation presque parfaite avec la courbe IV. En effet, pour tous les enregistrements, le coefficient de corrélation pour cette fréquence a été supérieure à 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, moyenne ± écart type). Quand nous regardons la figure 3A (conditions de contrôle), il n&#39;ya pas de fréquences en dehors de la composante continue dont l&#39;amplitude est corrélée de manière significative avec la courbe IV. Plus précisément, aucun de ces fréquences ont des coefficients de corrélation supérieur à 0,5. Lors de l&#39;insertion de la fonction de l&#39;amplitude du bruit le plus faible (50 mV), ces mêmes fréquences avaient encore les coefficients de corrélation inférieur à 0,5. Les coefficients de corrélation pour lesfréquences soi n&#39;a pas non plus devenir supérieure à 0,5 lorsque l&#39;amplitude du bruit a été augmenté à 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figure 1" /> . Figure 1 Recordings cellulaire Modèle: enregistrements pince de tension sont indiquées pour une cellule modèle sans (1A) et avec (1B) une fonction de bruit inclus dans le protocole échelon de tension. Pour la première et la dernière de 20 ms de chaque balayage, le potentiel a été maintenu à le potentiel de maintien (0 mV). Chaque étape de tension était de 80 ms de long, et la fonction de bruit a été inséré de 40 ms après le début de l&#39;étape. La fonction de bruit avaient une durée de 30 ms et contient des fréquences entre 1 et 15 kHz. La tension était intensifié BOF, -150 à +50 mV par incréments de 5 mV. Une courbe IV de la cellule de modèle est également montré (1C). Pour faire des enregistrements plus facile à lire, que chaque coup cinquième a été inclus dans 1A et 1B, mais tous les balayages ont été inclus dans 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 FFT d&#39;enregistrements:. La FFT a été calculé pour la portion de 30 ms de chaque balayage où la fonction de bruit doit être inséré (la zone délimitée par la boîte rouge dans les figures 1A, 1B). Figures 2A et 2B montrent la FFT calculée avec et sans la fonction de bruit, respectivement. Une fois encore, pour plus de clarté, seule la FFT de chaque balayage de cinquième est inclus dans le chiffre, mais tous les balayages ont été utilisées dans les calculs futurs. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figure 3" /> . Figure 3 Corrélations Fréquence IV: Les résultats des corrélations entre la courbe IV d&#39;un enregistrement et l&#39;amplitude des fréquences individuelles au cours de la série de mesures de tension est affichée. Les figures 1A - 1C montrent le coefficient de corrélation pour des fréquences allant de 0 à 20 kHz, dans des conditions de contrôle, et en présence de 50 ou 100 mV fonctions de bruit, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figure 4" /> La figure 4 re-création de la courbe IV:. La courbe IV de la cellule du modèle (le même que la figure 1C) et l&#39;ampleur des deux fréquences ont été superposées. La première fréquence est la composante continue (R = 0,995), et la seconde était une fréquence choisie au hasard avec une faible corrélation (R = 0,3212). Les amplitudes de fréquence ont été réduits à environ la même amplitude que la courbe IV.

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Il ya des obstacles techniques qui empêchent actuellement les chercheurs de mesurer plusieurs types de canaux ioniques simultanément avec l&#39;intention de déterminer plus tard, combien de courant devrait être attribué à chaque type de canal. En raison de cette limitation, les canaux ioniques sont généralement étudiés individuellement en utilisant des techniques telles que pince potentiel de tension, courant, et l&#39;action. 1 Pour étudier les types de canaux individuels, des systèmes d&#39;expression hétérologues sont souvent utilisés. 2 Lorsque vous travaillez avec des cellules isolées à partir de tissus, tels que les cardiomyocytes , d&#39;autres moyens doivent être utilisés pour bloquer les canaux ioniques différentes. Par exemple, les canaux sodiques peuvent être inactivés par une rampe de tension dépolarisants lente, 3 vers l&#39;intérieur des canaux potassiques rectifiant peut être bloqué par BaCl2 extracellulaire, 4 et canaux calciques peut être bloquée en utilisant le vérapamil 5. Une méthode utilisée qui surmonte partiellement cette limitation est de mesurer le flux de courant à travers deux canaux simultanément types, puis répéter la mesure après bloquant sélectivement un type de canal avec un agent approprié. Soustraction des deux mesures peuvent alors être utilisées pour estimer la quantité de courant attribuables au type de canal qui a été bloqué. 6 Toutefois, il existe deux principales limites à cette technique. Tout d&#39;abord, les agents chimiques n&#39;ont pas été identifiées qui peuvent bloquer sélectivement chaque canal ionique, et certains médicaments largement utilisés ont des interactions non spécifiques avec les types de canaux d&#39;autres. 5,7 seconde, il ne peut pas être déterminée à partir de cette technique si un canal est modulée par un autre canal. Par exemple, l&#39;expression hétérogènes de NAV 1.5 et 2.1 Kir a été montré dans les ventricules cochon de Guinée, et il a été suggéré que d&#39;une relation synergique existe entre les deux canaux, tels que la hausse Kir 2.1 expression dans le ventricule droit déprime la vitesse de conduction. Présentement 8 , cela ne peut pas être vérifiée. Dans cette étude, nous suggérons que la spectroscopie d&#39;impédance peut être un outil utile pour étudier plusieurs types de canaux ioniques mesurés simultanément. Bien que la méthode présentée n&#39;a jamais été utilisé à discerner les courants à partir de deux types de canaux mesurés simultanément, la spectroscopie d&#39;impédance a été utilisée pour étudier un certain nombre d&#39;autres aspects de la fonction des canaux ioniques. Goodman et Art montré en utilisant des cellules auditives de tortues de cheveux que les protocoles de pince de courant peut être modifiée pour accorder une cellule pour différentes fréquences, et les oscillations dans le potentiel transmembranaire est due à une interaction entre un intérieur rectifier canal K + et d&#39;un canal Ca 2 +. 9 Han et Frazier a démontré que l&#39;impédance peut être mesurée dans une cellule unique sur un large éventail de fréquences (100 Hz à 5 MHz), et l&#39;augmentation de l&#39;impédance observée lorsque K + ou Ca 2 + canaux ont été bloqués pourrait être un moyen simple de détecter les blocs de canaux en haute écrans de drogue débit. Hayashi et 10 ont utilisé la conductance Fishman complexe à étudier les propriétés cinétiques d&#39;un intérieur rectifier canal K +. 11 D&#39;autres groupes ont inséré une seule fréquence dans le protocole de voltage des types de canaux différents et a montré que la réponse en fréquence observée d&#39;accord avec la réponse attendue pour certaines fréquences mais pas les autres. 12,13 Millonas et Hanck suggéré la raison certaines fréquences ne produisent pas la réponse attendue est la présence de constantes de vitesse multiples dans le modèle de Markov. 12 Des études comme celles-ci, ainsi que d&#39;autres, ont démontré qu&#39;il ya des cas où des courants ioniques mesurés à partir des canaux ioniques tout en utilisant la spectroscopie d&#39;impédance ne sont pas d&#39;accord avec la réponse en fréquence théorique. Ce n&#39;est pas une préoccupation dans cette étude parce que le but de la méthode dans cette étude est d&#39;identifier des fréquences qui sont en corrélation avec l&#39;amplitude de courant indépendante du hypothèses sous-jacentes du circuit de la membrane électrique. Furtheremore, l&#39;amplitude du courant est calculé à partir de portions des enregistrements qui n&#39;ont pas de fonctions de bruit inséré dans eux. Un certain nombre d&#39;autres études également des modèles présents sur de nombreux canaux ioniques présentant de nombreux États la conduite et non-conduction ensemble avec leurs constantes de vitesse propres. 14,15,16 Thompson et al ont montré que le filtre de sélectivité du canal KcsA a différents sites de liaison pour Na +, Li + et K +, et les coûts énergétiques de passer d&#39;un site de liaison à l&#39;autre comme un bouge d&#39;ions à travers le filtre de sélectivité est ce qui rend le canal préférentiellement conduite ions K + à travers ses pores. 17 Dans ce papier nous avons inséré une gamme de fréquences (fonction de bruit) dans un protocole échelon de tension et cherché des fréquences dont l&#39;amplitude hautement corrélée avec l&#39;amplitude globale actuelle. Depuis des preuves solides a été présenté suggérant constantes de vitesse multiples jouent un rôle dans la conduction des ions à travers différent canaux, l&#39;introduction des fréquences associées à ces constantes de vitesse peut causer certaines fréquences de résonance ou fortement corrélée avec l&#39;amplitude du courant, ce qui n&#39;aurait pas autrement. La technique démontrée dans cette étude est réalisée sur une cellule du modèle, qui est un circuit RC parallèle qui est habituellement utilisé pour tester les circuits voltage et de l&#39;équipement d&#39;acquisition. Il n&#39;est pas prévu que toutes les fréquences en dehors DC serait en corrélation avec l&#39;ampleur actuelle, et cela est montré dans nos données. Nous montrons aussi que l&#39;ajout de la fonction de bruit ne cause aucun des fréquences à très corrélée avec l&#39;amplitude du courant. Ces deux constatations sont importantes parce qu&#39;elles montrent que l&#39;équipement de mesure et de la fonction du bruit ne cause aucun d&#39;eux-mêmes fréquences à corréler avec l&#39;amplitude du courant. Lorsque les études futures effectuer des mesures en utilisant des membranes contenant les canaux ioniques, il est prévu que, selon le canal utilisé, les fréquences qui correspondent aux constantes de vitesse dans le filtre de sélectivité ou, éventuellement, le pore va influencer la réponse en fréquence du canal et affecter les fréquences qui ont une grande ou de faible corrélation avec l&#39;amplitude du courant. Puisque cette méthode est une nouvelle technique pour étudier les canaux ioniques, il ya un certain nombre de directions futures études pourraient suivre. D&#39;abord, la technique devrait être utilisée pour caractériser la réponse en fréquence des canaux spécifiques isolées. D&#39;autres travaux doivent également être fait pour calibrer les amplitudes de fréquence pour les amplitudes actuelles. Une fois de multiples canaux sont caractérisés individuellement, plusieurs types de canaux doivent être mesurées simultanément. La technique pourrait aussi être adapté pour une utilisation dans la pince du potentiel d&#39;action, pince de courant, et les études de stimulation de champ. Bien que ce soit une nouvelle technique, il montre ce que peut être un moyen puissant de faire des mesures électrophysiologiques qui n&#39;étaient précédemment pas possible et de fournir de nouvelles perspectives intéressantes dans le rôle physiologique des canaux ioniques.

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<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
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<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
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<td>Headstage</td>
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<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
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<td>Digidata 1322A</td>
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<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

INTRODUCTION: Actuellement, il n&#39;existe aucune méthode établie pour mesurer plusieurs types de canaux ioniques simultanément et décomposer le courant mesuré en portions attribuables à chaque type de canal. Cette étude montre comment la spectroscopie d&#39;impédance peut être utilisée pour identifier des fréquences spécifiques qui hautement corrélée avec l&#39;amplitude état stable courant mesuré au cours des expériences de potentiel imposé. La méthode consiste à insérer une fonction de bruit contenant des fréquences spécifiques dans le protocole échelon de tension. Dans le travail présenté, une cellule modèle est utilisé pour démontrer qu&#39;aucun des corrélations élevées sont introduits par les circuits de voltage, et aussi que la fonction de bruit lui-même ne pas introduire de fortes corrélations quand aucun des canaux ioniques sont présents. Cette validation est nécessaire avant que la technique peut être appliquée à des préparations contenant des canaux ioniques. Le but du protocole présenté est de démontrer la façon de caractériser la réponse en fréquence d&#39;un type canal ionique unique à une fonction de bruit. Une fois les fréquences spécifiques ont été identifiés dans un type de canal individuel, ils peuvent être utilisés pour reproduire l&#39;état d&#39;équilibre actuel de tension (IV) la courbe. Les fréquences qui très corrélés avec un type de canal et peu corrélée avec les types de canaux d&#39;autres peuvent ensuite être utilisées pour estimer la contribution actuelle des types de canaux multiples mesurés simultanément. Méthodes: mesures avec la pince de tension ont été réalisées sur une cellule du modèle en utilisant un protocole standard de tension étape (-150 à +50 mV, 5mV étapes). Fonctions de bruit contenant grandeurs égales de 1-15 kHz fréquences (de zéro à amplitudes de crête: 50 ou 100 mV) ont été insérés dans chaque étape de tension. La composante réelle de la transformée de Fourier rapide (FFT) du signal de sortie a été calculée avec et sans bruit pour chaque étape potentiels. La grandeur de chaque fréquence en fonction de l&#39;étape de tension a été corrélée avec l&#39;amplitude du courant à la tension correspondante. RÉSULTATS ET CONCLUSIONS: En l&#39;absence de bruit (de contrôle), les grandeurs de toutes les fréquences, sauf la composante continue corrélée mal (| r | &lt;0,5) avec la courbe IV, tandis que la composante continue a un coefficient de corrélation supérieur à 0,999 dans toutes les mesures. La qualité de la corrélation entre les fréquences individuelles et la courbe IV ne change pas quand une fonction de bruit a été ajouté au protocole échelon de tension. De même, l&#39;augmentation de l&#39;amplitude de la fonction de bruit n&#39;a pas non plus augmenter la corrélation. Les mesures de contrôle montrent que le circuit de voltage par lui-même ne cause pas les fréquences au dessus de 0 Hz à grande corrélation avec la courbe de l&#39;état stationnaire IV. De même, les mesures en présence de la fonction du bruit de démontrer que la fonction de bruit ne provoque pas de fréquences au-dessus de 0 Hz à corréler avec la courbe de l&#39;état stationnaire IV quand aucun des canaux ioniques sont présents. Basé sur cette vérification, la méthode peut maintenant être appliqué à des préparations contenant un type d&#39;ions mono-canal avec l&#39;intention de fréquences dont l&#39;amplitude d&#39;identifier spécifiquement en corrélation avec ce type de canal.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Il ya des obstacles techniques à la mesure du flux de courant à travers les canaux ioniques multiples simultanément, et plus tard exigeants quelle portion du courant transmembranaire est due à chaque type de canal. Pour répondre à ce besoin, cette méthode présente un moyen pour générer la courbe IV de types de canaux individuels en utilisant des composants de fréquence spécifique.

Rappel d&#39;une courbe Ion Channel IV Utilisation des composants de fréquence

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

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Biology

13.4K vues.  University of Utah. Il ya des obstacles techniques à la mesure du flux de courant à travers les canaux ioniques multiples simultanément, et plus tard exigeants quelle portion du courant transmembranaire est due à chaque type de canal. Pour répondre à ce besoin, cette méthode présente un moyen pour générer la courbe IV de types de canaux individuels en utilisant des composants de fréquence spécifique.

Vidéo: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Principales composantes d&#39;un microscope optique

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caractérisation fonctionnelle de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l&#39;Ion sélectif microélectrodes Technique d&#39;auto-référencement

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...