この作品は、博士Poelzingに授与保健助成金番号R21 - HL094828 - 01の国立研究所によってサポートされていました。

1。ノイズ関数と入力信号を準備する<ol><li>所望の周波数成分を含むノイズ関数を作成します。これは、周波数領域で所望の周波数成分を記述し、逆高速フーリエ変換を計算することによって行うことができます。本研究では、1 - 15 kHzのを使用した。すべてのフーリエ変換、および本研究で説明されて逆フーリエ変換は、MatlabのFFTとIFFTの関数を用いて計算した。 </li><li>適切なノイズ関数の振幅をスケーリングします。本研究ではノイズ関数は、ノイズ関数の振幅をピークに、ゼロが50または100 mVであったようにスケーリングされた。 </li><li>使用されている買収のソフトウェアのための適切なメソッドを使用して、スティミュラスファイルを作成します。 Clampex 8では、まず、適切なヘッダーを持つテ​​キストフ​​ァイルを作成します。ヘッダの下に、最初の列にあるシングル掃引時間増分を挿入する。時間増分は、測定に使用されるサンプリング間隔と同じ時間間隔を持つ必要があります。電圧ステップのプロトコルで掃引ごとに各時間ステップごとに必要な正確な電圧を挿入する。これは、ノイズ関数を含める必要があります。 </li></ol> 2。電圧クランプ測定を実行<ol><li>以前に生成された刺激のファイルと互換性のある買収のソフトウェア内の測定プロトコルを作成します。 Clampexでは、ユーザーが現在のプロトコルで、スティミュラスファイルを関連付けることができるメニューがあります。 </li><li>測定機器のモデル（または生物学）細胞を取り付けます。 </li><li>予定通りの実験を行います。制御の目的のために、あらゆるノイズ関数が含まれていない定期的な測定値を含めるようにしてください。 </li></ol> 3。ポスト実験解析<ol><li>個々の記録のためのIV曲線を計算する。録音はノイズ関数が適用される定常状態にある場合は、IV曲線は、時間的にノイズ関数の範囲外の記録の定常状態の部分を使用して作成することができます。録音は、定常状態ではなかった場合、ノイズ関数は、IV曲線の計算を妨げる可能性、第2の記録が存在するノイズの機能なしで行われるはずです。 </li><li>記録の各電圧ステップのために高速フーリエノイズ関数が挿入された記録の部分の変換を計算する。 mはFFTの周波数の数であり、そしてnは電圧ステップ数であるamxn行列、に各電圧ステップのためのフーリエ変換を組み合わせる。この構成では、行列の各行は、実験のすべての電圧のステップで単一周波数の振幅を表しています。 </li><li>周波数ごとに（上記の行列の各行、すなわち）3.1で生成されたIV曲線を持つ行を相互に関連付けて、相関係数を記録。 </li><li>高度なIV曲線との相関の周波数を視覚化するために相関係数の対周波数のプロット。直流成分はFFTの最初の周波数に含まれているので、この周波数の相関係数は常に&gt; 0.99である必要があります。 </li></ol> 4。代表的な結果： 代表的な電圧クランプ測定は、電圧ステップのプロトコルに挿入されたノイズ関数なしで（図1A）と（図1B）を持つモデル細胞として使用されています。 IV曲線は、モデル細胞（図1C）を算出した。掃引ごとに、図1からの録音で、FFTは、ノイズ関数が挿入された時間枠（図1A、1Bに赤いボックスを参照）を基に計算した。図2Aおよび2Bは、それぞれ、図1Aおよび1Bに示されている録音のために計算されたFFTを示しています。目視検査の際、DC成分は、（赤で強調表示）IVカーブの形状を模倣するように表示されます。ノイズ関数がなければ、DC上のすべての周波数がゼロ（図2A）の近くで振幅を持っているように見えます。ノイズ関数が挿入されると、1〜15 kHzの間の周波数では、視覚的に顕著な振幅（図2B）を持っている。図3は、IV曲線に対する電圧のステップの範囲で個々の周波数の振幅を相関の結果を示しています。実験はそれぞれ、制御条件（無ノイズ関数）の下、50〜100mVのノイズの振幅が行われていたときに、図3A - Cは、相関係数を示しています。すべてのケースでの通知は、DC成分は、IV曲線でほぼ完全に相関することが表示されます。確かに、すべての録画のために、この周波数の相関係数は0.99（R = 0.9996 ± 1E - 5、平均値±標準偏差）以上であった。我々は図3Aの（コントロール条件）を見ると、振幅が大幅にIVカーブと相関する直流成分以外にも周波数はありません。特に、これらの周波数はいずれも0.5以上の相関係数を持っていません。最小の振幅のノイズ関数（50 mVの）を挿入すると、これらの同じ周波数でも、0.5よりも相関係数が少なくていた。の相関係数ノイズの振幅が100 mVに増加したときにSEの周波数は、0.5より大きくなっていませんでした。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="図1" /> 図1モデルセル録音：電圧クランプ記録は、電圧ステップのプロトコルに含まれるノイズの機能なし（1A）と（1B）でモデル細胞として使用されています。各スイープの最初と最後の20ミリ秒の場合、電位が保持電位（0 mV）で維持した。各電圧ステップは80 msの長さだった、とノイズ関数は、ステップの開始後40 msを挿入した。ノイズ関数は、30ミリ秒と1〜15 kHzの間に含まれる周波数の持続時間を持っていた。電圧は5 mV刻みで-150〜+50 mVに、あちこちに辞任した。モデルのセルのIV曲線は、（1C）が表示されます。読みレコーディングを簡単にするために、唯一の五回ごとの掃引は、1Aおよび1Bに含まれていましたが、すべてのスイープは、1Cに含まれていた。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：録音のFFT：FFTのノイズ関数は、（領域が図1A、1Bの赤いボックスで囲まれた）挿入される各スイープの30ミリ秒の部分について計算した。図2Aおよび2Bは、それぞれ、ノイズ関数なしとで計算されたFFTを示しています。もう一度、明確にするために、五回ごとにスイープからのみFFTは、図には含まれていますが、すべてのスイープは、将来の計算で使用されていた。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="図3" /> 図3のIVの周波数相関：記録のIV曲線と電圧ステップの範囲で個々の周波数の振幅との相関の結果が表示されます。図1A - 1Cは、それぞれ、制御条件の下で0〜20 kHzまでの周波数、および50または100 mVのノイズ関数の存在下で相関係数を、示す。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="図4" /> 図4のIV曲線の再作成：モデル細胞（図1Cと同じ）と2つの周波数の大きさのためのIV曲線を重ねていた。最初の周波数は、DC成分（R = 0.995）であり、2番目は低い相関（R = 0.3212）とランダムに選択された周波数でした。周波数の振幅は、IV曲線とほぼ同じ振幅に調整された。

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	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

現在、後で各チャンネルの種類に起因することがどの程度の電流を決定することを意図して同時に複数のイオンチャネルの種類の測定から研究者を防ぐための技術的な障害があります。この制限のため、イオンチャネルは、通常そのような、電圧電流、および活動電位クランプなどの手法を用いて図1は個々のチャネルの種類を調べるために、異種発現系を頻繁に使用されて個別に検討されている2などの心筋細胞などの組織から単離した細胞を操作するとき、他の手段は様々なイオンチャネルをブロックするために使用されている必要があります。例えば、ナトリウムチャネルが遅い脱分極電圧のランプにより失活することができる、3内向き整流カリウムチャネルは、細胞外BaCl2でブロックすることができる、4、カルシウムチャネルは、ベラパミルを使用してブロックすることができます5。 部分的にこの制限を克服する使用される一つの方法は、選択的に適切なエージェントを一つのチャネルタイプをブロックした後、測定を繰り返すと同時に、2つのチャネルタイプを介して現在のフラックスを測定することです。 2つの測定値の減算は、ブロックされたチャネルの種類に、現在の帰属する量を推定するために使用することができます。6しかし、この手法には2つの主要な制限があります。最初に、化学物質を選択的にそれぞれのイオンチャネルをブロックすることができます特定する、、と、いくつかの広く使用されている薬剤は、他の種類のチャネルとの非特異的相互作用を持ってされていない。5,7第二に、それは一つのチャネルが別によって変調されるかどうか、このテクニックから決定することはできないチャンネル。例えば、右心室の高いキール2.1式は伝導速度を押し下げるように、NAV 1.5、キール2.1の異種発現は、モルモットの心室に示されている、そしてそれが相乗関係が2つのチャネル間に存在することが示唆されている。現在8 、これは検証できません。 本研究では、インピーダンス分光法は、同時に測定した複数のイオンチャネルのタイプを研究するための有用なツールであることを示唆している。提示方法が同時に測定された2つのチャネルタイプから電流を識別するために使用されてもいないのに、インピーダンス分光法は、イオンチャネルの機能の他の面の数を研究するために使用されています。グッドマンとアートは、電流クランプのプロトコルが異なる周波数のセルを調整するように変更することができるカメの聴覚有毛細胞を用いて示し、膜電位の振動が内向き整流K +チャネルとCa 2 +チャネルの間の相互作用によるものです。 9漢とFrazier氏はそのインピーダンスは周波数の広い範囲（100 Hzから5 MHzの）上の単一のセルで測定することができます実証、及びK +又はCa 2 +チャネルがブロックされていたがための簡単な手段かもしれないときにインピーダンスの増加が観察さ高スループットの薬物画面でチャンネルのブロックを検出する。10林とフィッシュマンは、内向き整流K +チャネル。11その他のグループが異なる種類のチャネルの電圧クランププロトコルに単一の周波数を挿入しての運動特性を研究するために複雑なコンダクタンスを使用していることを示したこと予想されるいくつかの周波数の応答ではなく、他の人と合意された観測周波数応答。12,13 MillonasとHanckいくつかの周波数が予期される応答は、マルコフモデルで複数の速度定数の存在であることができなかった理由を提案した。このような12件の研究、としてだけでなく、他の人、インピーダンス分光法を使用しながら、イオンチャネルから測定したイオン電流は、理論的な周波数応答と一致していないインスタンスがあることを明らかにした。この研究ではメソッドの目的は、膜の電気回路の基礎的前提の独立した電流振幅との相関の周波数を識別することであるため、これは本研究では問題になりません。 Furtheremoreは、現在の振幅は、それらに挿入されたノイズ関数を持っていない記録の部分から計算されます。他の多くの研究が多数実施し、すべて自分の速度定数と非導通状態を示す多数のイオンチャネルのも現在のモデル。14,15,16 ThompsonらはKCSAチャネルの選択フィルターがNaのための別の結合部位を有することを示した+、Li +（リチウムイオン）、およびK +、および選択性フィルタを介してイオンの動きはチャネルが優先的に細孔を介してK +イオンを行って作るものであるとして1つの結合部位から別のものへ移るの精力的なコスト。17本稿では、範囲を挿入電圧ステップのプロトコルへの周波数（ノイズ関数）のと、その振幅は非常に全体の電流の振幅と相関して周波数を探した。強力な証拠が示唆して提示されているので、複数の速度定数は、差動を介してイオンの伝導の役割を果たすtのチャネルは、これらの速度定数に関連付けられている周波数の導入は、特定の周波数が共振するか非常に特に必要がないという現在の振幅、と相関する可能性があります。本研究で示さ技術は通常、電圧クランプ回路および収集装置をテストするために使用される並列RC回路であるモデルのセルで実行されます。それは、DC以外の任意の周波数が現在の大きさと相関することが期待されていない、とこれは私たちのデータで示されています。我々はまた、ノイズ関数の追加は任意の周波数が高く電流振幅と相関する可能性はなかったことを示している。彼らは、測定機器やノイズ関数は、それ自体で任意の周波数が電流振幅と相関が引き起こされないことを示すため、これら二つの知見は重要である。今後の研究は、イオンチャネルを含む膜を使用して測定を行う場合、それが使用されるチャネルに応じて、多分選択フィルターや細孔の速度定数に対応する周波数は、チャネルの周波数応答に影響を及ぼし、周波数が高い持っている影響を与える、ことが期待される電流振幅を持つか低い相関。 この方法はイオンチャネルを研究するための新しい手法であるため、今後の研究が続くことができる方向の数があります。最初に、技術は特定の絶縁チャンネルの周波数応答を特徴付けるために使用する必要があります。追加の作業はまた、現在の振幅に周波数の振幅を校正するために行われる必要があります。複数のチャネルを個別に特徴づけされると、複数のチャネルタイプを同時に測定する必要があります。技術はまた、活動電位クランプ、電流クランプ、およびフィールドの刺激の研究に使うために改変することができる。これは新しい手法ですが、これまで不可能だった電気生理学的測定を行い、イオンチャネルの生理的役割に貴重な新しい洞察を提​​供する強力な方法かもしれないかを示しています。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

はじめに：現在、同時に複数のイオンチャネルの種類を測定し、各チャネルの種類に起因する部分に測定された電流を分解するための確立された方法がない。この研究では、インピーダンス分光法は、高度電圧クランプの実験中に測定された定常状態の電流振幅が相関する特定の周波数を識別するために使用できる方法を示しています。方法は、電圧ステッププロトコルに固有の周波数を含むノイズ関数を挿入する伴います。出品作品では、モデル細胞がない、高い相関がなく、イオンチャネルが存在しないときにノイズ関数自体は高い相関を導入していないことも、電圧クランプ回路によって導入されない、とされていることを実証するために使用されます。技術がイオンチャネルを含有する製剤に適用する前にこの検証は必要です。提示プロトコルの目的は、ノイズ関数への単一のイオンチャネル型の周波数応答を特徴づける方法を示すことです。特定の周波数が個々のチャネルのタイプで識別されると、それらは定常状態の電流電圧（IV）曲線を再現するために使用することができます。非常に一つのチャンネルの種類と相関し、最低限、他のチャネルタイプと相関する周波数はして同時に測定された複数チャネルタイプの現在の貢献度を推定するために使用されることがあります。 【方法】電圧クランプの測定は、標準電圧のステップのプロトコール（-150〜+50 mVに、5mVのステップ）を使用して、モデルセルで行った。 1から15 kHzの周波数（ゼロのピーク振幅：50または100mV）の等しい大きさを含むノイズ関数は、各電圧ステップを挿入した。出力信号の高速フーリエ変換（FFT）の実際のコンポーネントは、各ステップの可能性のノイズがある場合とない場合を計算した。電圧ステップの関数として各周波数の大きさは、対応する電圧では電流振幅と相関していた。 結果と結論：ノイズの有無（制御）においては、直流成分を除く全ての周波数の大きさが不十分な相関（| R | &lt;0.5）IVカーブと、DC成分がすべての測定値で0.999よりも大きい相関係数を持っていたのに対し。ノイズ関数は、電圧ステップのプロトコルに追加されたときに、個々の周波数とIV曲線の間に相関関係の質は変化しなかった。同様に、ノイズ関数の振幅を大きくすると、相関を増加させなかった。コントロールの測定値は、それ自体で電圧クランプ回路が0 Hzより上の周波数は非常に定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。同様に、ノイズ関数の存在下での測定は、ノイズ関数は、イオンチャネルが存在しない場合には0 Hzより上の周波数は定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。この検証に基づいて、メソッドは現在、その振幅がそのチャネルの種類と特異的に相関の周波数を識別する目的で、単一のイオンチャネルの種類を含有する製剤に適用することができます。

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

貫​​通電流の一部は、各チャネルの種類に起因するものがある、同時に複数のイオンチャネルを流れる電流磁束を測定するための技術的な障害があり、後に目の肥えた。このニーズに対応するため、このメソッドは、特定の周波数成分を使用して、個々のチャネルタイプのIV曲線を生成する方法を示します。

周波数成分を用いたイオンチャネルのIV曲線の要約

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

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Biology

13.4K ビュー.  University of Utah. 貫​​通電流の一部は、各チャネルの種類に起因するものがある、同時に複数のイオンチャネルを流れる電流磁束を測定するための技術的な障害があり、後に目の肥えた。このニーズに対応するため、このメソッドは、特定の周波数成分を使用して、個々のチャネルタイプのIV曲線を生成する方法を示します。

ビデオ: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...