Ce travail a été soutenu par une subvention NSF RUI MCB-0950372 Caractérisation moléculaire droit de Black Silks Veuve.

1. Anesthésier l&#39;araignée et l&#39;isolement de l&#39;abdomen <ol><li> Transfert de l&#39;araignée d&#39;un bocal en verre dans une boîte en carton doublée de plastique (figure 1A). Nous recueillons généralement araignées de tas de bois, des garages ou des buissons et les loger dans le laboratoire dans des bocaux en verre. Parce que l&#39;araignée ne peut pas monter le revêtement en plastique, elle fournit une méthode efficace pour le transfert de l&#39;araignée à partir d&#39;un bocal en verre ou un café dans un petit peut flacon à des fins d&#39;anesthésier. Alors que la manipulation de l&#39;araignée à ce stade, vous devriez porter deux paires de gants en latex ou des gants de jardinage pour des raisons de sécurité. </li><li> Alors que l&#39;araignée est dans la boîte de doublés de plastique, l&#39;approche de l&#39;araignée de son dos et de laisser la lame d&#39;araignée dans le flacon de culture en plastique. Après l&#39;araignée pénètre dans le flacon, placer immédiatement la fiche sur le dessus (figure 1B). Nous vous recommandons d&#39;utiliser un flacon qui est d&#39;environ 101,6 mm x 31,75 mm (L x P). Cela réduit la quantité de dioxyde de carbone nécessaire pour l&#39;étape d&#39;anesthésier. </li><li> Anesthetize l&#39;araignée en introduisant du gaz dioxyde de carbone à 5-10 livres par pouce carré pendant 10 min (figure 1C). Cette quantité de gaz ne frappez l&#39;araignée pendant environ 5 min, donc après l&#39;anesthésie, vous devez immédiatement procéder aux étapes 1.4 à 1.5. </li><li> Placez l&#39;araignée anesthésiés dans un plat à la dissection de petits et de l&#39;utilisation des forceps pour la position de l&#39;araignée jusqu&#39;à côté dorsal (sablier rouge vers le bas). </li><li> Fixez le pédoncule (tige étroit reliant le céphalothorax et l&#39;abdomen) pour libérer l&#39;abdomen du reste de l&#39;araignée (figure 1D). Stocker le céphalothorax dans le congélateur une nuit dans une boîte de Pétri et jeter après gelé le lendemain. Soyez prudent lorsque vous déplacez le céphalothorax que les crocs de l&#39;araignée sont présents sur ce segment. </li><li> Fixez l&#39;abdomen pour le matériel Sylgard dans le plat de dissection petite aide d&#39;une épingle seul insecte. Insérer la broche d&#39;insectes à travers le trou fait par la coupure de pédoncule (figure 1E). Cela peut facilement être identifié comme le site où le fluide sort de l&#39;écrêtage du pédoncule. Assurez-vous de la filière (extrémité opposée du pédoncule) est orientée vers le bas (proche de chez vous). </li></ol> 2. Suppression de l&#39;exosquelette <ol><li> Faire la première incision grâce à l&#39;exosquelette utilisant une paire de microciseaux, en commençant par le trou à partir de la coupure de pédicelle. Couper latéralement jusqu&#39;à la face dorsale est atteint sur les deux côtés (figure 1F). En utilisant une paire de pinces, peler le segment antérieur et exosquelette insérer une seconde broche à cet endroit. Après l&#39;insertion du second axe, tourner le plateau de dissection caudalement (angle de 90 °) de la coupe latérale initiale et continue jusqu&#39;à ce que la découpe filières sont atteint (figure 1G). Cette incision sera perpendiculaire ou verticale pour la première coupe latérale. Ne pas couper à travers les filières où l&#39;incision verticale est faite (par rapport postérieur à la sablier et elle a un aspect circulaire). Le défaut d&#39;insérer les broches seconde se traduira dans l&#39;abdomen de tourner quand les incisions verticales sont réalisées. </li><li> Immerger l&#39;abdomen à disséquer une solution tampon (0,1 M de chlorure de sodium, 0,015 M citrate de sodium, 0,1% de diéthyle pyrocarbonate). </li><li> Peler l&#39;exosquelette reste en arrière à partir de l&#39;initiale, incision latérale. Lorsque cela est terminé, le tissu adipeux doit être clairement visible (figure 1H). </li></ol> 3. Isolement des glandes produisant la soie <ol><li> En utilisant une pince commencer à démêler l&#39;écart de la couche de graisse (figure 1H). La graisse aura une couleur blanchâtre à l&#39;aspect jaunâtre. Continuez jusqu&#39;à ce que la plupart des graisses est enlevé et les glandes de soie sont clairement visibles. La glande tubuliform se compose de trois paires de très longues, des tubes cylindriques qui sont abondants dans la cavité abdominale. Le ampullate majeur, qui se trouve dans les paires, est une ampoule grand croissant, en forme avec une longue queue distaux et un conduit proximale qui diminue de largeur à l&#39;approche de filières de l&#39;araignée. Le ampullate mineur est très similaire en morphologie à l&#39;ampullate majeur, mais il est nettement plus petit. La glande flagelliformes, également en paires, est ronde et multilobulaire avec une petite cylindriques en zig-zag conduit qui s&#39;étend vers le bas vers les filières. La glande totale (en paires) est un très grand, la glande multilobulaire qui a un canal excréteur très important qui a de grands lobes irréguliers sur elle. Les glandes acinus se produisent en grand nombre et ressemblent à court, projections fingerlike petits. La glande piriforme est la plus petite glande située dans l&#39;abdomen et a beaucoup compacté, conduits cylindriques qui ressemblent à un ventilateur avec de nombreux petits canaux excréteurs qui s&#39;étendent jusque dans les filières. </li><li> Nous vous conseillons de retirer les glandes dans l&#39;ordre suivant: tubuliform, ampullate majeur, flagelliformes, ampullate mineur, globalement, acinus, et ensuite le piriformes (Figure 2A-B). </li><li> En commençant par le tubuliform, taquiner ces glandes hors du reste de l&#39;eglandes e - ils doivent être assis sur le dessus des autres glandes (figure 2A). Il ya trois paires de glandes tubuliform dans une araignée unique. Permettez-leur de flottement libre, mais restent attachés à leurs filières par leurs conduits. </li><li> Ensuite, l&#39;écart taquiner les glandes ampullate majeur. Il ya deux glandes ampullate majeurs présents dans une araignée. Pendant la procédure de retrait, assurez-vous les gaines restent attachés à des glandes (figure 2A). </li><li> Continuer à taquiner le reste de la glande loin les uns des autres, à travailler avec soin pour éviter toute perforation de la glande, en particulier l&#39;agrégat et les glandes flagelliformes. Chaque glande devrait être libre flottante tout le chemin à son point de sortie dans l&#39;exosquelette pour les filières. Ces glandes sont également trouvés dans les paires. Retirez chaque glande en pinçant le conduit avec une pince et tirant doucement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se détache du point de sortie. Le ampullate majeur, flagelliformes, ampullate mineur, et les glandes agrégées sont trouvés dans les paires. Les glandes piriformes acinus et se produisent dans de nombreuses paires de plus. </li><li> Retirez chaque glande en pinçant le conduit avec une pince et tirant doucement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se détache du point de sortie par la filière. Nous stockent généralement les glandes humides, cependant, nous n&#39;ajoutons pas de tampon supplémentaire. </li><li> Comme les glandes sont supprimés, les placer dans stériles pré-étiquetées 1,5 ml microtubes. Glandes individuels sont présentés dans la figure 3A-G. Conservez ces glandes sur la glace, puis les congeler éclair dans l&#39;azote liquide. Suite à la congélation instantanée dans l&#39;azote liquide, placez-les à -80 ° C pour le stockage. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Lors de la suppression des glandes différentes, un soin extrême doit être pris pendant la manipulation du flagelliformes et les glandes agrégées, comme ces deux structures peuvent être facilement perforés et endommagé avec la pince. Par ailleurs, il est à noter que les glandes morphologiquement flagelliformes et d&#39;agrégat sont très similaires avant leur retrait et ils sont souvent étroitement liés les uns aux autres. Pour prévenir la contamination croisée de ces tissus lors de l&#39;enlèvement, le dissecteur devrait soigneusement taquiner ces structures à part. De plus, lors de l&#39;exposition initiale de la production de soie glandes, les glandes et les acinus piriformes sera le plus difficile à visualiser immédiatement en raison de leur petite taille et la localisation anatomique. Souvent, il ya la présence de nombreux œufs. Par ailleurs, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l&#39;enlèvement de la glande pyriforme, que ce tissu est extrêmement collante et adhèrent souvent à votre pince. Lorsque cette procédure est faite correctement, il est possible d&#39;obtenir les sept glandes productrices de soie d&#39;une araignée seule manière hautement purifié. Typiquement, on peut récupérer des quantités de microgramme d&#39;ARN total et de protéines à partir d&#39;une dissection d&#39;araignée unique. Un exemple d&#39;utilisation de l&#39;ARN total pour qPCR à examiner les taux d&#39;ARNm d&#39;un gène tubuliform restreint fibroïne, TuSp1, est illustré (Figure 4). Représentant des expériences qui impliquent des protéines de lysats recueillis par les glandes, par exemple en solution de digestion tryptique suivie par MS analyse (pourrait aussi être utilisé pour MS / MS) ou une analyse d&#39;acides aminés composition est indiquée (figure 5-6, respectivement). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figure 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figure 1e" /> Figure 1. Manutention, anesthésiant, et le retrait de l&#39;exosquelette de l&#39;abdomen d&#39;une araignée veuve noire femelle. A) Transfert de l&#39;araignée dans une boîte en carton doublé de plastique pour faciliter le déplacement de l&#39;araignée dans un flacon en plastique plus petites. B) Spider placé dans un flacon en plastique avec bouchon. C) L&#39;anesthésie de l&#39;araignée avec du gaz de dioxyde de carbone. D) la séparation du céphalothorax de l&#39;abdomen à l&#39;aide microciseaux. E) Immobilisation de l&#39;abdomen dans le plateau de dissection utilisant des broches d&#39;insectes. F) Voir, après une incision latérale est faite avec des ciseaux et une partie de l&#39;exosquelette est abrogé retour avec une pince. G) Les incisions faites perpendiculairement à la première coupe latérale. H) la révocation de l&#39;exosquelette et l&#39;exposition de la couche de graisse. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Visualisation des sept différentes glandes productrices de soie tandis intacte dans l&#39;abdomen de l&#39;araignée ainsi que les tissus environnants. A) Images de la tubuliform, ampullate majeur, flagelliformes, globalement, les tissus ampullate mineure à un grossissement de 12X. B) l&#39;image de l&#39;acinus et les glandes piriformes à un grossissement de 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="La figure 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figure 3e" /> Photographies Figure 3. Des sept soie glandes productrices après leur retrait de l&#39;abdomen. Toutes les images ont été capturées à un grossissement de 20x à l&#39;exception de l&#39;acinus et les glandes piriformes, qui ont été fait à 40X. Un important)ampullate glande; B) ampullate majeurs et mineurs (côté droit) pour comparaison de taille; C) tubuliform; D) flagelliformes; E) des agrégats; F) acinus; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Les résultats représentatifs Figure 4. Du patron d&#39;expression du gène de la soie, TuSp1, après l&#39;arpentage de la TuSp1 les niveaux d&#39;ARNm dans les différents soie glandes productrices (hors de la glande piriformes) à l&#39;aide quantitative PCR en temps réel (qPCR) isolement suivantes de l&#39;ARN total à partir les glandes. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Exemple d&#39;analyse de MS d&#39;extraits protéiques obtenus à partir de la glande piriformes suivants en solution de digestion tryptique. Remarque: x2 représente deux fois de grossissement de l&#39;intensité du spectre. Messes spectre des ions peptidiques qui correspondent aux régions de la fibroïne PySp1 sont affichés avec le symbole #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Résultat typique du profil de composition en acides aminés des protéines extraites de la glande tubuliform. Remarque: ASX = Asp et Asn; GLX = Glu et Gin. Coloration bleue reflète acides aminés avec des groupes polaires chaîne latérale tandis coloration rouge représente les résidus d&#39;acides aminés avec des groupes non polaires chaîne latérale.

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	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Notre méthodologie pour la microdissection des glandes produisant la soie de l&#39;araignée veuve noire offre un moyen efficace d&#39;obtenir hautement purifiées de la soie des glandes productrices. Les dissections peuvent être complétés dans 1,5 à 3 heures, ce qui donne un ensemble complet de sept distincts de soie des glandes productrices d&#39;cobweavers. Obtention hautement purifiées de la soie de la glande échantillons permet aux enquêteurs la possibilité d&#39;effectuer un large éventail d&#39;études ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Araignées modernes tour des fibres de soie de haute performance avec une large gamme de fonctions biologiques, y compris la locomotion, la proie saisie et la protection de développer 1,2 progéniture. Araignées accomplir ces tâches en faisant tourner plusieurs types de fibres distinctes qui ont diverses propriétés mécaniques. Une telle spécialisation des types de fibres a eu lieu à travers l&#39;évolution des différentes glandes productrices de soie, qui fonctionnent comme des bio-usines de petite taille. Ces bio-usines de fabrication et de stocker de grandes quantités de protéines de soie pour la production de fibres. Grâce à une série complexe d&#39;événements biochimiques, ces protéines de soie sont convertis à partir d&#39;un liquide dans un matériau solide lors de l&#39;extrusion. Des études ont démontré que mécanique soies d&#39;araignée sont plus forts que l&#39;acier à haute résistance 3. Analyses de comprendre la relation entre la structure et la fonction des fils de soie d&#39;araignée ont révélé que la soie d&#39;araignée se compose essentiellement de protéines, ou fibroins, qui ont dans leurs répète bloc de séquences de protéines 4. Commune signatures moléculaires qui contribuent à la résistance à la traction incroyable et l&#39;extensibilité de la soie d&#39;araignée sont démêlé au travers des analyses d&#39;ADNc de soie traduits. Etant donné les propriétés du matériau extraordinaire de soies d&#39;araignée, les laboratoires de recherche à travers le monde font la course à comprendre et à imiter les processus de filage pour produire des fibres de soie synthétique pour des applications commerciales, militaires et industriels. Un des principaux défis à la filature de la soie d&#39;araignée artificielle dans le laboratoire de recherche implique une compréhension complète des processus biochimiques qui se produisent lors de l&#39;extrusion des fibres provenant des glandes de soie producteurs. Nous présentons ici une méthode pour l&#39;isolement des sept producteurs de soie différentes glandes de l&#39;araignée veuve noire cobweaving, qui comprend les glandes ampullate majeurs et mineurs [fabrique de soie et d&#39;échafaudages dragline] 5,6, tubuliform [synthétise la soie cas d&#39;œuf] 7 , 8, flagelliformes [fonction inconnue en torchis-tisserands], granulats [rend la soie colle], acinus [emballage proies synthétise et les discussions à oeufs] 9 et piriformes [produit l&#39;attachement de la soie disque] 10. Cette approche est basée sur anesthésier l&#39;araignée avec du gaz de dioxyde de carbone, la séparation ultérieure du céphalothorax de l&#39;abdomen, et microdissection de l&#39;abdomen afin d&#39;obtenir les glandes produisant la soie. Après la séparation des différentes glandes productrices de soie, ces tissus peuvent être utilisés pour récupérer des macromolécules différentes pour différentes analyses biochimiques, y compris quantitative PCR en temps réel, dans le nord-ouest et le buvard, spectrométrie de masse (MS ou MS / MS) des analyses pour identifier nouvelles séquences de protéines de soie, la recherche de protéines qui participent à la voie d&#39;assemblage de soie, ou utiliser les tissus intacts pour la culture cellulaire ou d&#39;expériences histologiques.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l&#39;abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l&#39;isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d&#39;une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d&#39;araignée et de l&#39;assemblage de fibres.

Microdissection de Black Widow Soie d&#39;araignée des glandes productrices

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

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Biology

15.7K vues.  University of the Pacific. Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l'abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l'isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d'une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d'araignée et de l'assemblage de fibres.

Vidéo: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection des glandes salivaires de l&#39;intestin moyen et Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Recherche

Biologie

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Microdissection laser des tissus de mammifères

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Reconstruction de 3-Dimensional Volume histologique et son application à l&#39;étude de souris glandes mammaires

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Rongeur de travail Modèle de coeur pour l&#39;étude de la performance myocardique et la consommation d&#39;oxygène

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...