Bu çalışma, Black Widow Spider ipek bir NSF RUI Hibe MCB-0950372 başlıklı Moleküler Karakterizasyonu tarafından desteklenmiştir.

1. Karın örümcek ve izolasyon anestezi <ol><li> Plastik (Şekil 1A) ile kaplı bir karton kutunun içine bir cam kavanoz örümcek aktarın. Biz genellikle woodpiles, garajlar ya da çalılar örümcekler toplamak ve laboratuvarda cam kavanoz içinde onlara ev. Örümcek plastik astarı yukarı tırmanmak değil, çünkü bir cam kavanoz ya da kahve örümcek anestezi amaçlı küçük bir şişenin içine aktarmak için etkili bir yöntem sağlar. Bu noktada örümcek işleme, iki çift lateks eldiven veya güvenlik amaçlı bahçe eldiven giyiyor olmalıdır. </li><li> Örümcek kutusundaki plastik ile kaplı olmasına rağmen, arka yaklaşım ve örümcek örümcek slayt, plastik kültürü şişe içine sağlar. Örümcek flakon girdikten sonra hemen üst (Şekil 1B) üzerinden fiş yerleştirin. Biz yaklaşık 101.6 mm x 31.75 mm (L x D) bir şişe kullanmanızı öneririz. Bu anestezi adım için gerekli karbon dioksit gazı miktarını en aza indirir. </li><li> Inç kare başına 10 dakika (Şekil 1C) 5-10 kilo karbondioksit gazı getirerek örümcek anestezisi. Bu miktar sadece gaz anesthetization sonra hemen adımları 1,4-1,5 geçmemiz gereken, yaklaşık 5 dakika süreyle örümcek knock out olacak. </li><li> Anestezi örümcek, küçük bir diseksiyon çanak içine yerleştirin ve örümcek dorsal yüzü yukarı (kırmızı kum saati aşağı bakacak şekilde) pozisyonu için forseps kullanabilir. </li><li> Örümcek geri kalanı (Şekil 1D) karın serbest sapçık (Sefalotoraks ve karın bağlayan dar sapı) Clip. Petri geceleme dondurucu cephalothoraksın Mağaza ve ertesi gün dondurulmuş sonra atın. Örümcek kıskaçlar bulunan bu segmentte cephalothoraksın taşırken dikkatli olun. </li><li> Tek bir böcek pin kullanarak küçük diseksiyonu çanak Sylgard malzeme karın sabitleyin. Sapçık kırpma (Şekil 1E) yapılan delikten böcek pimi takın. Bu sıvı sapçık kırpma çıkan site olarak kolayca tespit edilebilir. Düze (sapçık diğer ucunu) (size en yakın) alt yönlediriyor emin olun. </li></ol> 2. Exoskeleton kaldırılması <ol><li> Sapçık kırpma delik başlayan, bir microscissors çifti kullanılarak dış iskelet ile ilk kesi olun. Dorsal yüzü her iki tarafında (Şekil 1F) ulaşana kadar yanal kesin. Ön dış iskelet segmentinde kabuğu, bir çift forseps kullanma ve bu yerde ikinci bir iğne takın. Ikinci pin ekleme takiben, ilk yanal kesim kaudal diseksiyon tepsi (90 ° açı) açın ve memeciklerin (Şekil 1G) ulaşana kadar kesme devam edin. Bu kesi ilk yanal kesme dik veya dikey olacaktır. Düşey kesi yapılır memeciklerin (kum saati posterior akrabası ve dairesel bir görünüme sahiptir) ile kesmeyin. Ikinci pin eklemek için dikey insizyonlar yapılır iplik karın neden olacaktır. </li><li> Batmak tampon solüsyonu (0.1 M Sodyum Klorür, 0.015 M Sodyum Sitrat,% 0.1 Pyrocarbonate Dietil) diseksiyon karın. </li><li> Geri kalan dış iskelet Peel ilk yatay kesi başlayarak. Bu tamamlandığında, yağ dokusu (Şekil 1H) açıkça görünür olmalıdır. </li></ol> 3. Ipek üreten bezlerin izolasyonu <ol><li> Forseps kullanarak yağ tabakası (Şekil 1H) uzak alay başlar. Yağ beyazımsı ve sarımsı görünümüne sahip olacak. Çoğu yağ çıkarılır ve ipek bezleri açıkça görülebilir kadar devam edin. Tubuliform bezi, karın boşluğunda bol, çok uzun, silindirik tüpler üç çift oluşur. Çift halinde bulunan büyük ampullate, uzun dolambaçlı bir distal kuyruk ve örümcek memeciklerin yaklaşımlar olarak genişliği azalır proksimal kanalı ile büyük bir hilal şeklinde ampulla. Küçük ampullate büyük ampullate morfolojisi çok benzer, ancak önemli ölçüde küçüktür. Aynı zamanda çiftleri meydana flagelliform bezi, yuvarlak ve aşağı memeciklerin doğru uzanır kanalı zig-zag bir küçük silindirik multilobular. Toplam bezi (çift), üzerinde büyük, düzensiz lob vardır çok büyük bir boşaltım kanalı çok geniş, multilobular bezi. Aciniform bezleri çok sayıda ortaya çıkar ve kısa, küçük parmak projeksiyonları benzerler. Piriform bezi karında küçük bir bezdir ve memeciklerin aşağı uzanan birçok küçük boşaltım kanalları ile bir fan benzer birçok sıkıştırılmış, silindirik kanalları vardır. </li><li> Piriform (Şekil 2A-B), daha sonra tubuliform, büyük ampullate flagelliform, küçük ampullate, agrega, aciniform ve: Biz aşağıdaki sırayla bezleri kaldırarak öneririz. </li><li> Tubuliform ile başlayarak, yüzyılın geri kalanında bu bezleri kapalı kızdırmake bezleri diğer bezleri (Şekil 2A) üstüne oturuyor olmalıdır. Tek bir örümcek tubuliform bezlerinin üç çift vardır. Halka açık ama kendi kanalları kendi memeciklerin bağlı kalmasını sağlayın. </li><li> Sonra, büyük ampullate bezleri kızdırmak. Bir örümcek bulunan iki büyük ampullate bezleri vardır. Kaldırma işlemi sırasında, kanallar bezleri (Şekil 2A) bağlı kaldığından emin olun. </li><li> , Özellikle agrega ve flagelliform bezleri bezleri delinmesiyle önlemek için dikkatli bir şekilde çalışan, birbirinden uzakta bezlerinin geri kalanı tease devam edin. Her bezi memeciklerin Exoskeleton çıkış noktası her şekilde yüzen arındırılmış olmalıdır. Bu bezler aynı zamanda çift olarak bulunurlar. Forseps ile kanal kısma ve onu çıkış noktası tatili kadar dikkatle çekerek her bezi çıkarın. Büyük ampullate, flagelliform, küçük ampullate, ve toplam bezlerinin çiftleri bulundu. Aciniform ve piriform bezleri çok daha fazla çiftleri meydana gelir. </li><li> Her bezi kanalı kısma ve forseps ile düze çıkış noktası aşağı uzak bozulana kadar dikkatle çekerek çıkarın. Biz genellikle bezleri ıslak saklamak, ancak ek tampon ilave etmeyiniz. </li><li> Bezleri çıkarılır, ön etiketli steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yerleştirin. Bireysel bezleri Şekil 3A-G gösterilmiştir. Bu bezlerin buz üzerinde tutun ve sonra flaş sıvı nitrojen dondurma. Koyun sıvı nitrojen içinde flaş dondurma, -80 ° C depolama için. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Flagelliform ve toplam bezlerinin işleme sırasında bu iki yapının kolayca delinmiş ve forseps ile hasar gibi farklı bezleri çıkarırken, çok dikkatli alınması gerekmektedir. Ayrıca, morfolojik flagelliform ve toplam bezleri önce kaldırılması çok benzer ve çoğu zaman birbirleri ile iç içe olduğunu fazlalaştı. Disektör dikkatle bu dokuların çıkarılması üzerine çapraz bulaşmayı önlemek için, bu yapıların dışında kızdırmak olmalıdır. Ayrıca, ilk poz ipek üreten bezlerin üzerine, aciniform ve piriform bezleri, küçük boyut ve anatomik konumu nedeniyle hemen görselleştirmek için en zor olacaktır. Genellikle çok sayıda yumurta varlığı yoktur. Ayrıca, bu doku son derece yapışkan ve forseps sık sık uyacaktır ek bakım, piriform bezi çıkarırken alınması gerekir. Bu işlem doğru yapıldığında, son derece saf bir şekilde tek bir örümcek tüm yedi ipek üreten bezlerin elde etmek mümkündür. Genellikle, bir, tek bir örümcek diseksiyonu toplam RNA ve protein mikrogram miktarlarda kurtarabilirsiniz. Tubuliform kısıtlanmış fibroin gen, TuSp1 mRNA düzeylerini incelemek için qPCR için toplam RNA kullanarak bir örnek gösterilmiştir (Şekil 4). Protein bezleri alınan lizatları içeren Temsilcisi deneyler MS analizi (MS / MS analizi için kullanılan olabilir) ya da bir amino asit kompozisyonu analizi (sırasıyla Şekil 5-6) gösterilir takip çözüm triptik sindirim gibi. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Şekil 1e" /> Şekil 1 Taşıma, anestezi ve dış iskelet bir kadın kara dul örümceğinin karın kaldırılması. A) örümcek, daha küçük bir plastik şişenin içine örümcek hareket kolaylaştırmak için plastik ile kaplı bir karton kutunun içine aktarın. B) Örümcek fişli bir plastik şişenin içine yerleştirilir. C) örümcek karbondioksit gazı ile etkisiz. D) Cephalothoraksın microscissors kullanarak karın ayrılması. E) böcek pimleri kullanarak diseksiyon tepsi karın İmmobilizasyon. F) makas ve dış iskelet bir kısmını forseps ile geri soyulmuş lateral kesi yapıldıktan sonra gör. G) Kesiler ilk yanal kesme dik yapılmaktadır. H) yağ tabakasının dış iskelet ve pozlama kaldırılması. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, örümcek gibi çevre dokulara karın dokunmamak yedi farklı ipek üreten bezlerin Görselleştirme . A) tubuliform Görüntüler, büyük ampullate flagelliform, toplam 12X büyütme, küçük ampullate dokular. B) 12X büyütme aciniform ve piriform bezleri Resim. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Şekil 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Şekil 3e" /> Şekil 3 karından çıkarılmasından sonra yedi ipek üreten bezlerin Fotoğraflar. 20X büyütme 40X az yapıldı aciniform ve piriform bezleri, istisna ile tüm görüntüler ele geçirildi. A) büyükampullate bezi B) boyut karşılaştırma için büyük ve küçük ampullate (sağ tarafı); C) tubuliform; D) flagelliform; E) agrega; F) aciniform G) piriform. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 toplam RNA kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) aşağıdaki izolasyon kullanarak farklı ipek üreten bezlerin TuSp1 mRNA düzeylerini ölçme sonra ipek gen TuSp1 (piriform bezi hariç) ifade desen Temsilcisi sonuçları bezlerinin. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 çözüm triptik sindirim aşağıdaki piriform bezinden elde edilen protein ekstreleri MS analizi örneği . Not: x2 spektrumunun 2 kat büyütme temsil eder. PySp1 fibroin bölgelere karşılık gelen Spektrum peptid iyon kitleler # sembolü ile gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 tubuliform bezinden çıkarılan proteinlerin amino asit kompozisyonu profili tipik sonucudur. Not: ASX = Asp ve Asn; GLX = Glu ve Gln. Mavi rengi, kırmızı renklenme, polar olmayan yan zincir grupları ile amino asit artıkları temsil eder, oysa amino asitler polar yan zincir grupları ile yansıtır.

<ol>
	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Kara dul örümceği ipek üreten bezlerin mikrodiseksiyon metodolojisi yüksek derecede saflaştırılmış ipek üreten bezlerin elde etmek için etkili bir araç sunmaktadır. Diseksiyonlarının yedi ayrı komple bir set ipek üreten bezlerin cobweavers gelen verimli 1,5 ila 3 saat içinde tamamlanabilir. Yüksek derecede saflaştırılmış ipek bezi örnekleri elde edilmesi araştırmacılar farklı bezlerinde seçici genlerin mRNA düzeyleri kütle spektrometresi, analiz kullanarak glandüler luminal içeriğini ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Modern örümcekler, biyolojik fonksiyonları, hareket, avlarını yakalamak ve gelişmekte olan yavrular 1,2 korunması da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede yüksek performanslı ipek lifleri dönerler. Örümcekler farklı mekanik özelliklere sahip birkaç farklı fiber türleri iplik bu görevleri yerine getirmek. Bu tür uzmanlık elyaf türleri küçük biofactories olarak işlev farklı ipek üreten bezleri, evrimle meydana gelmiştir. Bu biofactories üretimi ve elyaf üretimi için ipek proteinleri büyük miktarlarda saklamak. Biyokimyasal olayların karmaşık bir dizi sayesinde, bu ipek proteinleri ekstrüzyon üzerine sağlam bir malzeme bir sıvı haline dönüştürülür. Mekanik çalışmalar örümcek ipek yüksek gerilimli çelik 3 daha güçlü olduğunu göstermiştir. Analizler örümcek ipek ipler yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için, örümcek ipeği, büyük ölçüde onların protein dizileri içinde 4 blok tekrarlar proteinler, ya da fibroins ibaret olduğunu ortaya koymuştur. Inanılmaz bir örümcek ipek çekme dayanımı ve genişletilebilirlik katkıda Ortak moleküler imzalar tercüme ipek cDNAs analizleri ile sökülmüş edilmektedir. Örümcek ipekler olağanüstü malzeme özellikleri göz önüne alındığında, dünya çapında araştırma laboratuarları, ticari, askeri ve endüstriyel uygulamalar için sentetik ipek lifleri iplik üretmek için süreci anlamak ve taklit etmek için yarış halindeler. Araştırma laboratuvarı yapay örümcek ipeği iplik temel güçlüklerden biri, ipek üreten bezlerin lifleri ekstrüzyon esnasında meydana gelen biyokimyasal süreçlerin tam bir anlayış içerir. Burada yedi farklı ipek üreten bezlerin büyük ve küçük ampullate bezleri içeren cobweaving kara dul örümceğinin, 5,6, tubuliform [sentezler yumurta durumda ipek] [paletli vinç ve iskele ipek üreten] 7 izolasyonu için bir yöntem mevcut , 8, flagelliform [koçanı-dokumacılar bilinmeyen işlev] [tutkal ipek, toplam yapar] aciniform [sentezler av sarma ve yumurta durumda konuları] 9 ve piriform 10 [Ek disk ipek üretir]. Bu yaklaşım, karbondioksit gazı, karın cephalothoraksın sonraki ayırma ve ipek üreten bezlerin elde etmek için karın, mikrodiseksiyon örümcek anestezi dayanmaktadır. Farklı ipek üreten bezlerin ayrılmasını takiben, bu dokularda belirlemek için kantitatif gerçek zamanlı PCR, kuzey-ve batı blot, kütle spektrometresi (MS veya MS / MS) analizleri de dahil olmak üzere farklı biyokimyasal analizler için farklı makromoleküllerin almak için kullanılabilir yeni ipek protein dizileri, ipek montaj yolu katılırlar, ya da sağlam doku, hücre kültürü veya histolojik deneyler için kullanmak proteinleri araştırın.

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands at JoVE.com

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Görüntüleme.  University of the Pacific. Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Video: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biyoloji

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...