Questo lavoro è stato supportato da una RUI NSF Concessione MCB-0950372 dal titolo Caratterizzazione molecolare di Sete Ragno Nero Widow.

1. Anestetizzare il ragno e l&#39;isolamento del ventre <ol><li> Trasferire il ragno da un vaso di vetro in una scatola di cartone foderato con plastica (Figura 1A). Noi di solito raccolgono ragni da cataste di legna, garage o cespugli e ospitarli in laboratorio in contenitori di vetro. Perché il ragno non può salire il rivestimento in plastica, fornisce un metodo efficiente per trasferire il ragno da un vaso di vetro o di latta di caffè in una piccola fiala per scopi anestetizzante. Durante la manipolazione del ragno, a questo punto, si dovrebbe indossare due paia di guanti in lattice o guanti da giardinaggio per motivi di sicurezza. </li><li> Mentre il ragno è in cassa foderata con la plastica, l&#39;approccio del ragno dalla sua parte posteriore e lascia la diapositiva ragno nel flaconcino cultura di plastica. Dopo il ragno entra nella fiala, immediatamente posto il tappo sopra la parte superiore (Figura 1B). Si consiglia di utilizzare un flacone che è di circa 101,6 millimetri x 31,75 millimetri (L x P). Questo minimizza la quantità di anidride carbonica necessaria per la fase di anestetizzante. </li><li> Anestetizzare il ragno con l&#39;introduzione di anidride carbonica a 5-10 libbre per pollice quadrato per 10 min (Figura 1C). Questa quantità di gas solo battere il ragno fuori per circa 5 minuti, così dopo anestesia si deve immediatamente procedere ai passaggi 1,4-1,5. </li><li> Posizionare il ragno anestetizzato in un piatto dissezione piccole e utilizzare pinze per posizionare il lato dorsale fino ragno (clessidra rosso rivolto verso il basso). </li><li> Agganciare il pedicello (fusto stretto che collega il cefalotorace e l&#39;addome) per rilasciare l&#39;addome dal resto del ragno (Figura 1D). Conservare il cefalotorace nel congelatore durante la notte in una capsula di Petri e scartare dopo congelato il giorno successivo. Fare attenzione quando si sposta il cefalotorace come le zanne del ragno sono presenti su questo segmento. </li><li> Fissare l&#39;addome al materiale Sylgard nel piatto dissezione piccolo utilizzando un singolo pin di insetti. Inserire il perno degli insetti attraverso il foro fatto dal ritaglio pedicello (figura 1E). Questo può essere facilmente identificata come il luogo in cui il fluido è che emerge dal taglio della pedicello. Assicurarsi che la filiera (estremità opposta del pedicello) è orientata verso il basso (più vicino). </li></ol> 2. La rimozione del esoscheletro <ol><li> Fare la prima incisione attraverso l&#39;esoscheletro usando un paio di microscissors, partendo dal foro dal ritaglio pedicello. Tagliare lateralmente fino a quando il lato dorsale si raggiunge su entrambi i lati (Figura 1F). Usando un paio di pinze, staccare il segmento anteriore esoscheletro e inserire un secondo perno in questa posizione. Dopo l&#39;inserimento del secondo perno, girare il vassoio dissezione caudale (90 ° angolo) dai tagli laterali iniziale e continuare a tagliare fino al raggiungimento filiere (figura 1G). Questa incisione sarà perpendicolare o verticale per il taglio iniziale laterale. Non tagliare le filiere in cui l&#39;incisione verticale è fatto (relativamente posteriori alla clessidra e ha un aspetto circolare). Il mancato inserire il secondo perno si tradurrà in addome filatura quando le incisioni verticali vengono eseguiti. </li><li> Immergere l&#39;addome nella dissezione soluzione tampone (0,1 M cloruro di sodio, citrato di sodio 0,015 M, 0,1% dietilico pirocarbonato). </li><li> Sbucciate l&#39;esoscheletro residua a partire dalla iniziale, incisione laterale. Quando questo è completato, il tessuto adiposo deve essere chiaramente visibile (Figura 1H). </li></ol> 3. Isolamento della seta ghiandole che producono <ol><li> Forcipe utilizzando cominciare prendere in giro via lo strato di grasso (Figura 1H). Il grasso avrà un aspetto biancastro a giallastro. Continuare fino a quando la maggior parte del grasso viene rimosso e le ghiandole della seta sono chiaramente visibili. La ghiandola tubuliform è composto da tre coppie di molto lungo, tubi cilindrici che sono abbondanti nella cavità addominale. Il ampullate principali, che si trova in coppia, è un grande ampolla a forma di mezzaluna con una lunga coda contorti distali e prossimali un condotto che riduce in larghezza che si avvicina filiere del ragno. Il ampullate minori è molto simile nella morfologia del ampullate importanti, ma è significativamente più piccola. La ghiandola flagelliform, si verificano anche in coppia, è rotonda e multilobari con un cilindrico piccolo zig-zag condotto che si estende verso il filiere. La ghiandola aggregato (che si trova in coppia) è un grande, ghiandola multilobari che ha un dotto escretore di grandi dimensioni che ha grandi lobi irregolari su di esso. Le ghiandole aciniforme si verificano in gran numero e assomigliano a breve, proiezioni fingerlike piccoli. La ghiandola piriforme è la più piccola ghiandola nell&#39;addome e ha molte compattato, condotti cilindrica che assomigliano a un ventilatore con molti dotti escretori piccoli che si estendono fino al filiere. </li><li> Si consiglia di rimuovere le ghiandole nel seguente ordine: tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, ampullate minori, aggregati, aciniforme, e poi il piriforme (Figura 2A-B). </li><li> A partire dal tubuliform, prendere in giro queste ghiandole fuori del resto del secologhiandole e - dovrebbero essere seduto sulla cima delle altre ghiandole (Figura 2A). Ci sono tre coppie di ghiandole tubuliform in un ragno singolo. Consentire loro di galleggiare liberamente, ma rimangono attaccati alla loro filiere da loro condotti. </li><li> Poi, via i stuzzicare ghiandole ampullate principali. Ci sono due ghiandole ampullate principali presenti in un ragno. Durante la procedura di rimozione, assicurarsi che i condotti rimangono attaccati alle ghiandole (Figura 2A). </li><li> Continuare a stuzzicare il resto delle ghiandole distanza gli uni dagli altri, lavorando con attenzione per evitare la puntura qualsiasi delle ghiandole, in particolare l&#39;aggregato e delle ghiandole flagelliform. Ogni ghiandola dovrebbe essere libero flottante fino al punto di uscita in esoscheletro al filiere. Queste ghiandole si trovano anche in coppia. Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita. Il ampullate principali, flagelliform, ampullate minori, e le ghiandole aggregati si trovano a coppie. Le ghiandole aciniforme e piriforme si verificano in molte coppie più. </li><li> Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita dalla filiera. Noi di solito archiviare le ghiandole bagnato, tuttavia, non aggiungere ulteriore cuscinetto. </li><li> Come le ghiandole vengono rimossi, mettetele in sterili pre-etichettati tubi da 1,5 ml microcentrifuga. Ghiandole individuale sono indicati nella figura 3A-G. Tenere queste ghiandole sul ghiaccio e poi il flash li congelare in azoto liquido. A seguito di congelamento flash in azoto liquido, deve tenerli a -80 ° C per la conservazione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Durante la rimozione delle ghiandole differenti, la cura estrema dovrebbe essere presa durante la manipolazione del flagelliform e delle ghiandole aggregata, in quanto queste due strutture possono essere facilmente perforati e danneggiato con le pinze. Inoltre, vale la pena notare che morfologicamente le ghiandole flagelliform e aggregati sono molto simili prima della loro rimozione e sono spesso intrecciate tra loro. Per evitare la contaminazione incrociata di questi tessuti dopo la rimozione, il dissettore attentamente prendere in giro queste strutture a parte. Inoltre, dopo l&#39;esposizione iniziale della seta ghiandole che producono, le ghiandole aciniforme piriforme e sarà la più difficile da visualizzare immediatamente a causa della loro dimensione e della localizzazione anatomica. Spesso vi è la presenza di molte uova. Inoltre, la cura supplementare deve essere presa durante la rimozione della ghiandola piriforme, in quanto questo tessuto è estremamente appiccicoso e spesso aderiscono al forcipe. Quando questa procedura viene effettuata correttamente, è possibile ottenere tutte e sette le ghiandole che producono la seta di un ragno solo in un modo altamente purificato. Tipicamente, si può recuperare quantità microgrammi di RNA totale e proteine ​​da una dissezione ragno singolo. Un esempio di utilizzo del RNA totale per qPCR di esaminare i livelli di mRNA di un gene tubuliform limitato fibroina, TuSp1, viene visualizzato (Figura 4). Esperimenti di rappresentanza che coinvolgono proteine ​​lisati raccolti dalle ghiandole ad esempio in soluzione digestione trittico seguito da MS (potrebbe anche essere utilizzato per MS / MS) o un aminoacido analisi composizione in acidi è mostrato (Figura 5-6, rispettivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" /> Figura 1. Manipolazione, anestetizzante, e la rimozione del esoscheletro dall&#39;addome di un ragno femmina vedova nera. A) Cessione del ragno in una scatola di cartone rivestito in plastica per facilitare lo spostamento il ragno in un flacone di plastica più piccoli. B) Spider inserito in una fiala di plastica con tappo. C) Anestesia il ragno con il gas di anidride carbonica. D) La separazione del cefalotorace con l&#39;addome con microscissors. E) Immobilizzazione dell&#39;addome nel cassetto sezionare con perni di insetti. F) Visualizza dopo una incisione laterale è realizzato con le forbici e una porzione di esoscheletro è sbucciata indietro con le pinze. G) Le incisioni in corso perpendicolare al taglio iniziale laterale. H) La rimozione del esoscheletro e l&#39;esposizione dello strato di grasso. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualizzazione dei sette diverse ghiandole che producono la seta, mentre intatto nell&#39;addome del ragno così come i tessuti circostanti. A) Immagini della tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, aggregare, tessuti ampullate minori con ingrandimento 12X. B) Immagine delle ghiandole aciniforme e piriforme con ingrandimento 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" /> Fotografie Figura 3. Dei sette seta ghiandole che producono dopo la loro rimozione dall&#39;addome. Tutte le immagini sono state catturate a 20X di ingrandimento, con l&#39;eccezione del aciniforme e ghiandole piriforme, che sono stati fatti a 40X. A) maggioreampullate ghiandola; B) ampullate maggiori e minori (lato destro) per la valutazione del peso; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregato, F) aciniforme; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" /> I risultati rappresentativi figura 4. Dei pattern di espressione del gene di seta, TuSp1, dopo i rilievi TuSp1 livelli di mRNA nelle diverse ghiandole che producono la seta (esclusa la ghiandola piriforme) utilizzando quantitativa real-time PCR (qPCR) isolamento successivo di RNA totale da le ghiandole. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Esempio di analisi MS di estratti proteici ottenuti dalla ghiandola piriforme seguenti soluzione digestione trittico. Nota: x2 rappresenta 2 volte ingrandimento di intensità dello spettro. Spettro masse di ioni peptide che corrispondono alle regioni del fibroina PySp1 sono indicati con il simbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Risultato tipico del profilo di composizione amino acidi delle proteine ​​estratte dalla ghiandola tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Colorazione blu riflette aminoacidi con gruppi polari catena laterale, mentre la colorazione rossa rappresenta residui di aminoacidi con gruppi laterali non polari a catena.

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	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La nostra metodologia per la microdissezione della seta ghiandole che producono dalla vedova nera offre un mezzo efficace per ottenere altamente purificato seta ghiandole che producono. Dissezioni può essere completato in 1,5 a 3 ore, producendo un set completo di sette distinte seta ghiandole che producono da cobweavers. Ottenere altamente purificato seta ghiandola campioni consente agli investigatori la possibilità di eseguire una vasta gamma di studi biochimici, inclusa l&#39;identificazione di seta o di nuove prot...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Ragni moderni rotazione ad alte prestazioni fibre di seta con una vasta gamma di funzioni biologiche, compresa la cattura delle prede locomozione, lo sviluppo e la protezione di 1,2 figli. Ragni eseguire queste operazioni da diversi tipi di filatura di fibre distinte che hanno diverse proprietà meccaniche. Specializzazione di tale tipi di fibre si è verificato attraverso l&#39;evoluzione delle diverse ghiandole che producono la seta, che funzionano come biofabbriche di piccole dimensioni. Queste produzione biofabbriche e archiviare grandi quantità di proteine ​​della seta alla produzione di fibre. Attraverso una complessa serie di eventi biochimici, queste proteine ​​della seta vengono convertite da un liquido in un materiale solido su di estrusione. Gli studi hanno dimostrato che la meccanica seta di ragno sono più forti di acciaio ad alta resistenza 3. Le analisi per comprendere la relazione tra la struttura e la funzione di fili di seta di ragno hanno rivelato che la seta di ragno è costituito in gran parte delle proteine, o fibroins, che hanno ripete blocco all&#39;interno del loro sequenze di proteine ​​4. Comune firme molecolari che contribuiscono alla resistenza alla trazione incredibile e l&#39;estensibilità di seta di ragno vengono svelati attraverso l&#39;analisi di cDNA seta tradotte. Date le straordinarie proprietà del materiale di ragno sete, laboratori di ricerca in tutto il mondo fanno a gara per capire e simulare il processo di filatura per la produzione di fibre di seta sintetica per applicazioni commerciali, industriali e militari. Una delle sfide principali di filatura della seta artificiale ragno in laboratorio di ricerca comporta una completa comprensione dei processi biochimici che si verificano durante l&#39;estrusione di fibre della seta ghiandole che producono. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento di sette diverse ghiandole che producono la seta dal ragno cobweaving vedova nera, che include le ghiandole ampullate maggiori e minori [produce seta dragline e ponteggi] 5,6, tubuliform [seta uovo sintetizza caso] 7 , 8, flagelliform [funzione sconosciuta in pannocchia-tessitori], aggregato [rende seta colla], aciniforme [preda sintetizza il confezionamento e le discussioni caso uovo] 9 e piriforme [attaccamento produce seta disco] 10. Questo approccio si basa su anestetizzare il ragno con il gas di anidride carbonica, successiva separazione del cefalotorace con l&#39;addome, e microdissezione del ventre per ottenere le ghiandole che producono la seta. Dopo la separazione dei diversi seta ghiandole che producono, questi tessuti possono essere utilizzati per recuperare le macromolecole diverse per distinte analisi biochimiche, tra cui quantitativa real-time PCR, nel nord-ovest e assorbente, la spettrometria di massa (MS o MS / MS), analisi per identificare nuove sequenze di proteine ​​della seta, ricerca per le proteine ​​che partecipano al percorso di assemblaggio di seta, o utilizzare il tessuto intatto per colture cellulari o esperimenti istologici.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l&#39;addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l&#39;isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l&#39;assemblaggio delle fibre.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  University of the Pacific. Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.

Video: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Ricerca

Biologia

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Ricostruzione di 3-Dimensional Volume Istologia e la sua applicazione per studiare mouse ghiandole mammarie

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Indagando Teliospore germinazione utilizzando analisi Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...