この作品は、ブラックウィドウのクモの糸の分子特性と題されたNSF RUIグラントMCB - 0950372によってサポートされていました。

1。腹部のスパイダーと分離して麻酔<ol><li>プラスチック（図1A）を敷いた段ボール箱にガラスの瓶から蜘蛛を転送します。我々は一般的にwoodpiles、ガレージや茂みからスパイダーを収集し、ガラス容器の実験室でそれらを収容する。スパイダーは、プラスチックライニングを登っことができないので、麻酔の目的で小さな瓶にガラスの瓶やコーヒーが缶fromスパイダーを転送するために効率的な方法を提供する。この時点でクモを処理する際に、安全のためにラテックス手袋や園芸用手袋の2つのペアを着用してください。 </li><li>クモは、プラスチックと並ぶボックスになっている間は、その裏面からクモに近づくとプラスチック培養瓶にクモのスライドをしましょう​​。スパイダーは、バイアルに入った後、すぐに（図1B）上からプラグインを置きます。我々は、約101.6ミリメートルX 31.75ミリメートル（L x奥行）であるバイアルを使用することをお勧めします。これは、麻酔の手順に必要な炭酸ガスの量を最小限に抑えます。 </li><li> 10分（図1C）のために平方インチあたり5〜10ポンドで炭酸ガスを導入することでクモを麻酔。ガスのこの量は、その麻酔後すぐにステップ1.4から1.5に進む必要があります、約5分間スパイダーをノックアウトされます。 </li><li>小さな解剖皿に麻酔スパイダーを置き、クモ背側を上（赤い砂時計が下向き）の位置に鉗子を使用する。 </li><li>スパイダー（図1D）の残りの部分から腹部を解放するために（頭胸部と腹部をつなぐ細い茎）小花柄のクリップ。ペトリ皿の中で一晩冷凍庫で頭胸部を格納し、次の日、凍結後に廃棄する。蜘蛛の牙が、このセグメント上に存在するとして、頭胸部を移動する際には注意してください。 </li><li>単一の昆虫ピンを使用して小さな解剖皿にSylgard材料に腹部を固定します。小花柄のクリッピング（図1E）から作られた穴から昆虫ピンを挿入します。これは簡単に流体が小花柄のクリッピングから浮上しているサイトとして識別することができます。紡糸口金（小花柄の反対側が）（あなたの近くの）底の方を向くことを確認してください。 </li></ol> 2。外骨格の除去<ol><li>小花柄のクリッピングから穴から始まる、microscissorsのペアを使用して外骨格を通して最初の切開を加えます。背側の両側（図1F）に到達するまで横方向にカット。ピンセット、ピールバック前外骨格のセグメントを使用し、この位置に2番目のピンを挿入します。紡糸口金に達するまでつ目のピンの挿入に続いて、（図1G）、最初の横カットから尾側に解剖用トレイ（90 °の角度を）回してカット続けます。この切開は、最初の横カットに垂直または垂直になります。縦切開が行われる紡糸口金（砂時計の後の相対的な、それが円形の外観を持っている）カットスルーしないでください。つ目のピンを挿入する失敗は、縦切開が行われるときに回転腹部になります。 </li><li>緩衝液（0.1M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、ピロジエチル0.1％）解剖で水没腹部。 </li><li>最初、横切開から始まる残りの外骨格のバックピール。これが完了すると、脂肪組織では（図1H）はっきりと見えるはずです。 </li></ol> 3。絹生産腺の単離<ol><li>鉗子を使用すると、脂肪層（図1H）を離れていじめ始める。脂肪は黄色がかった外観に白っぽいを持つことになります。脂肪のほとんどが削除され、絹糸腺がはっきりと表示されるまで続けます。小管状の腺は、腹腔内に豊富に存在が非常に長く、円筒管の三対で構成されています。ペアで発見された主要なampullateは、、長い複雑な遠尾と、それはクモの紡糸口金に近づくにつれて幅が減少する近位ダクトを持つ大規模な、三日月型の膨大部です。マイナーampullateは、主要なampullateの形態に非常に似ていますが、それは非常に小型です。また、ペアで発生した鞭毛状の腺は、紡糸口金に向かって伸びる小さな円筒形のジグザグダクト付きラウンドと多小葉のである。集計腺は（ペアで見つかった）その上に大規模な、不規則な葉を持つ、非常に大規模な導管を持つ、非常に大規模な、多小葉の腺です。房状の腺が大量に発生し、短い、小さな指状の突起に似ている。梨状腺は、腹部に小さな腺で、紡糸口金下に拡張する多くの小さな排泄ダクト付きファンに似ている多くの圧縮、円筒状のダクトを持っています。 </li><li>梨状（図2A - B）その後小管状の、主要なampullate、鞭毛状の、マイナーampullate、集計、房状の、そして：私たちは、次の順序で腺を削除することをお勧めします。 </li><li>小管状の以降では、番目の残りの部分のこれらの腺を薄くそぐE腺は - 彼らは他の腺（図2A）の上に座ってする必要があります。単一のクモの小管状の腺の3組あります。それらはフリーフロートが、そのダクトが彼らの紡糸口金に添付しておくことができます。 </li><li>次に、主要なampullate腺を離れていじめる。 one蜘蛛に存在する2つの主要なampullate腺があります。取り外し手順で、ダクトは腺（図2A）に接続されたままにことを確認してください。 </li><li> 、特に骨材および鞭毛状の腺の腺のいずれかに穴を開けることを避けるために慎重に作業し、互いに離れる腺の残りの部分をいじめるし続ける。各腺は、紡糸口金の外骨格にその終了時点までのすべての方法をフローティング自由であるべきです。これらの腺はまたペアで発見されています。鉗子でダクトをつまんで、それが離れて出口ポイントから解除するまで慎重に引いて、各腺を削除します。主要なampullate、鞭毛状の、マイナーampullate、および集約腺はペアで見られる。房状のと梨状腺はより多くのペアで発生する。 </li><li>鉗子でダクトをつまんで、それが紡糸口金で離れて出口点から故障するまで慎重に引いて、各腺を削除します。我々は一般的にウェット腺を保存しますが、我々は追加のバッファを追加しないでください。 </li><li>腺が削除されると、滅菌済みの標識を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れます。個々の腺は、図3A - Gに示されています。氷の上にこれらの腺を維持し、フラッシュは、液体窒素でそれらを凍結。液体窒素で瞬間冷凍に続いて、-80に配置° Cを貯蔵するため。 </li></ol> 4。代表的な結果鞭毛状の、集計腺の処理中にこれらの2つの構造が容易に穿刺し、鉗子で損傷することができるように別の腺を削除する際に、細心の注意は、注意が必要です。さらに、それは形態的に鞭毛状の、集約腺は前の彼らの除去に非常に似ていると彼らはしばしば互いに絡み合っていることは注目に値する。除去時にこれらの組織の交差汚染を防ぐために、解析部は慎重にこれらの構造体を離れていじめるしてください。さらに、絹生産腺の初期の暴露により、房状のと梨状腺は、直ちに、その小さいサイズと解剖学的位置のために視覚化する最も困難になります。しばしば多くの卵の存在がある。この組織は非常に粘着性であり、しばしばあなたの鉗子などが付着するようにまた、追加のケアは、梨状腺を削除するときは注意が必要です。この手順が正しく完了すると、それは高度に精製された方法で単一のクモからすべての7つの絹生産腺を得ることができる。通常の場合、単一のクモの解剖からトータルRNAとタンパク質のマイクログラム量を回復することができます。小管状の制限されたフィブロイン遺伝子、TuSp1、のmRNAレベルを調べるために定量PCRのためのトータルRNAを使用しての例では（図4）示されています。タンパク質溶解物を含む代表的な実験では、腺から収集例えばMSの分析（また、MS / MS分析に使用できる）や、アミノ酸組成分析で、続いて、ソリューショントリプシン消化（それぞれ図5-6、）表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="図1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="図1e" /> 図1。取り扱い、麻酔、そして女性のクロゴケグモの腹部から外骨格の除去。小さなプラスチック製のバイアル瓶にクモを動かしやすくするためにプラスチックが並ぶ段ボール箱にスパイダーのA）移転。 B）Spiderはプラグのプラスチックバイアル瓶に入れ。 C）炭酸ガスでクモを麻酔。 microscissorsを使用して腹部から頭胸部のD）分離。虫ピンを使用して解剖トレイの腹部のE）固定。横切開ははさみで作られており、外骨格の部分が鉗子でバックpealedされた後、F）の表示。 G）切開は、最初の横カットに対して垂直に作られて。脂肪層の外骨格と露出のH）除去。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。クモだけでなく、周囲の組織の腹部の中に無傷の7種類のシルク生産腺の可視化。小管状ののA）画像、主要なampullate、鞭毛状の、12X倍率で集計、マイナーampullate組織。 12Xの倍率で房状のと梨状腺のB）イメージ。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="図3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="図3e" /> 腹部からそれを除去するから七絹生産腺の図3。写真。すべての画像は40Xで行われた房状のと梨状腺、の例外を除いて20倍の倍率で捕獲された。 A）主な腺をampullate、サイズの比較のためにB）のメジャーとマイナーampullate（右側）、C）小管状の、D）鞭毛状の、E）の集約、F）房状の、G）洋梨形。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。絹の遺伝子の発現パターンの代表的な結果は、TuSp1、から全RNAの単離後、定量リアルタイムPCR（定量PCR）を使用して別のシルク生産腺（梨状腺を除く）におけるTuSp1 mRNAのレベルを調査した後腺。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。トリプシン消化、溶液中で以下の梨状腺から得られたタンパク質抽出物のMS分析の例。注：X2は、スペクトル強度の2倍の倍率を表す。 PySp1フィブロインの領域に対応するスペクトルペプチドイオンの質量は、＃記号で表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="図6" /> 図6小管状の腺から抽出したタンパク質のアミノ酸組成プロファイルの典型的な結果。注：ASX = AspとAsnの、GLX = GluとGlnの。赤い着色が非極性側鎖基を持つアミノ酸残基を表すのに対し、青い着色が極性側鎖基を有するアミノ酸を反映している。

<ol>
	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

クロゴケグモから絹糸を生産腺のマイクロダイセクションのための私たちの方法論は、高度に精製されたシルク生産腺を得るために効果的な手段を提供しています。解剖は、7つの別の完全なセットシルク生産cobweaversから腺をもたらして、1.5〜3時間で完了することができます。高度に精製されたシルク腺のサンプルを得ることが選択的に別の腺で発現する遺伝子のmRNAレベルの分析、研究者の...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

現代のスパイダーは、子孫の1,2の開発の運動、餌捕獲と保護を含む生物学的機能の広い範囲で高性能な絹繊維をスピン。スパイダーは、多様な機械的性質を持っているいくつかの異なるファイバータイプを紡糸して、これらのタスクを完了する。繊維の種類のそのような専門化は、小さなbiofactoriesとして機能する別のシルク生産腺、の進化を通じて発生しています。これらbiofactoriesの製造と繊維の生産のための絹タンパク質を大量に保管してください。生化学的な一連の複雑なイベントを通じ、これらの絹タンパク質は、押し出し時に固体材料に液体から変換されます。 機械的な研究は、クモの糸は、高張力鋼3より強いことが実証されている。クモの糸糸の構造と機能の関係を理解するために分析は、クモの糸は、主としてそれらのタンパク質配列4内のブロックの繰り返しを持つタンパク質、またはフィブロイン、から成ることが明らかになっている。信じられないほどの引張強さとクモの糸の拡張性に貢献する共通の分子の署名は、翻訳絹のcDNAの解析によって解明されています。クモ絹の特別な材料特性を考えると、世界中の研究所では、商業用、軍事および産業用アプリケーションのための合成絹の繊維を製造する紡糸プロセスを理解し、模倣するために争って。研究室で人工的なクモの糸を紡績する主な課題の一つは、シルク生産腺からの繊維の押出し時に発生する生化学的プロセスの完全な理解を伴います。 ここでは、7種類のシルク生産のメジャーとマイナーampullate腺を含むcobweavingクロゴケグモ、から腺を5,6、小管状の[合成の卵のケースのシルク] [ドラグラインと足場絹を製造している] 7の単離のための方法を提示、8、鞭毛状の[COB -織工の未知の機能]、集計[接着剤の糸を作る]、房状の[合成の獲物のラッピングと卵のケーススレッド] 9と梨状10 [アタッチメントディスクの絹を作り出す]。このアプローチは、二酸化炭素ガス、腹部から頭胸部のその後の分離、およびシルク生産腺を得るために腹部のマイクロダイセクションでクモを麻酔に基づいています。別のシルク生産腺の分離に続いて、これらの組織は、質量分析（MSまたはMS / MS）分析を識別するために、北部、およびウェスタンブロット法、定量的リアルタイムPCRを含む別個の生化学的解析、のために異なる高分子を取得するために使用することができます新しい絹タンパク質配列、絹のアセンブリの経路に関与する、または細胞培養または組織学的実験のために無傷の組織を使用するタンパク質の検索。

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

ここでは、女性の黒い未亡人のクモの腹部から、絹を生産腺を除去する効率的な戦略について説明します。この手順では、高度に精製されたファッションの7つの別のシルク生産腺、クモの糸生産と繊維集合体を研究する研究者のための重要なプロセスの迅速な分離が可能になります。

ブラックウィドウスパイダーシルクを生産腺の顕微解剖

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K ビュー.  University of the Pacific. ここでは、女性の黒い未亡人のクモの腹部から、絹を生産腺を除去する効率的な戦略について説明します。この手順では、高度に精製されたファッションの7つの別のシルク生産腺、クモの糸生産と繊維集合体を研究する研究者のための重要なプロセスの迅速な分離が可能になります。

ビデオ: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

生物学

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Microrespiration 分析と顕微解剖を使用して冬の発芽を調査

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...