Agradecemos Hyewon Cooper para las ilustraciones.

1. Disección Solución salina Cucaracha utilizado en todo este protocolo tiene la siguiente composición: Solución salina Cucaracha 36: (gramos por 100 ml) 210 mM de NaCl (1,227 g) 2,9 mM de KCl (0,0216 g) 1,8 mM de CaCl 2 (0,0265 g) 0,2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1,8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7.2. Ajustar el pH con NaOH 1 M o HCl 1 M). <ol><li> Seleccionar una cucaracha macho del tanque de retención que tiene cercos robusta (Figura 1). Los últimos segmentos del macho son estrechas en comparación con el sexo femenino, y que no contiene ovarios y masa de huevos, los machos son más fáciles de diseccionar. Los machos de P. americana tienen un par de estiletes corto entre la cercos. Estos lápices ópticos no se observan en las hembras. </li><li> Cortar las alas, las patas y la cabeza y el pin del cuerpo, ventral hacia arriba, a una dish forrado con elastómero de silicona. </li><li> Con unas pinzas recogen las placas ventrales y quienes las cortan con tijeras finas, comenzando en el extremo posterior y el trabajo anterior. Siempre mantenga los órganos internos húmeda con solución salina al tratar de mantener el cercos seco. Uno puede usar cera o piezas de goma para colocar los arriba abdomen para evitar que la solución salina de mojar la cercos. Si no se mojan, séquelos con un trozo de papel de seda. Empuje a un lado los órganos internos y la sustancia blanca (grasa corporal). El VNC es en el centro del campo, corre a lo largo del abdomen y debe ser visible entre las tráqueas brillante. El cordón nervioso es translúcido y puede ser inicialmente difícil de ver hasta que la iluminación está ajustado correctamente (Figura 2). NO manipule el VNC con fórceps o pins de insectos, sino manipularlo utilizando sondas de vidrio. </li><li> Despejar sistema de tráqueas de los animales de la mejor manera posible a partir del cordón nervioso con fórceps y con un par de necesidad vidrio finoles, dividió con mucho cuidado las conectivas VNC longitudinalmente entre A6 y A5 o A5 y A4 ganglios (Figura 3). Cuna del cercos y el abdomen hacia arriba fuera del baño de solución salina con alfileres de insectos acortados y la cera o una cuña de elastómero de silicona que se puede cortar para adaptarse a la preparación (Figuras 4A y B). Tenga mucho cuidado en el último segmento abdominal de no dañar los nervios Cercal que se proyectan en el ganglio (Figuras 2D y 5). </li></ol> 2. Registro extracelular <ol><li> El aparato de preparación, microscopio, y la grabación diseccionado debe ser configurado dentro de una jaula de Faraday para bloquear particularmente de CA, campos externos, eléctricos que podría invalidar señales de las neuronas (Figura 6). </li><li> Coloque el microscopio de modo que es con vistas a la platina del microscopio. Una vez que la preparación se coloca en el escenario, ajuste la posición del haz de iluminación de alta intensidadpara una visualización óptima de la misma. </li><li> Conecte el amplificador diferencial AC / DC a la unidad de registro de datos integrado (información sobre la configuración de hardware y software específicos han sido previamente descrito 25). La etapa de la cabeza que sostiene un electrodo de succión debe ser conectado al amplificador. Un cable de tierra de plata que ha sido recubierto con Cl - insertado en los resultados abdomen en grabaciones más estables. La razón es que si la solución en la cavidad del cuerpo no está en contacto con el fluido de baño en el plato, el fluido asociado con el electrodo de registro permanece conectado a tierra. </li><li> Establezca la frecuencia de grabación de 4 kHz. Establecer la escala de tensión (eje y) a 500 mV (esto se puede ajustar para optimizar la visualización de la traza). Ejecutar el software de grabación en el modo continuo o un osciloscopio para registrar la actividad neuronal en respuesta a estímulos. </li><li> Cortar una de las conectivas VNC cerca de A5 y colocar el extremo cortado unido a A6 en un electrodo de succión. Asegúrese de pull solución salina en el electrodo de succión para cubrir el alambre de plata en su interior antes de chupar en el nervio. </li><li> Con un golpe de aire seco en la pipeta a los pelos situados en cada cercus. A ver si la estimulación de los pelos en el ipsilateral cercus al conectivo registrado da una respuesta diferente a la contralateral. Tomar nota de la amplitud de las respuestas y el número de picos en un intervalo de tiempo dado durante la estimulación. </li><li> Mueva el electrodo de succión a un nervio cercal para la grabación. Para conseguir un mejor ajuste, cambie a una punta del electrodo con una apertura más pequeña si es necesario. </li><li> Cortar el nervio cerca cercal a A6 y luego aspirar el nervio que conduce a la cercus. No debe haber activación espontánea de los potenciales de acción. Ahora, soplar aire en el Cerco y anote las respuestas. </li></ol> 3. La estimulación eléctrica de los nervios sensoriales para determinar Reclutamiento <ol><li> Cambiar el software de grabación en el modo de barrido para que grabe los rastros (100-500 msec). cada vez que un estímulo se activa. </li><li> Conectar el electrodo de estimulación a la salida del estimulador. </li><li> Conecte el cable del estimulador con los dos cables mini-ganchos o clips. </li><li> Conecte la salida de disparo BNC del estimulador de la entrada de disparo de la unidad de grabación. </li><li> Los siguientes parámetros de estimulación deben evocar una respuesta: Duración: 0,3 seg; retardo: 10 ms; frecuencia: 1 Hz; Voltaje: ajustar según sea necesario para obtener una señal en las grabaciones (justo por encima del umbral y ser capaz de obtener una respuesta máxima). No hay razón para ir a voltajes mucho más altos que el umbral máximo para la contratación como un alto voltaje puede ser perjudicial para el nervio. </li><li> Cortar el nervio cercal como distal posible para que una raíz nerviosa de largo se puede tirar en el electrodo de succión estimulante (Figura 7, punta de flecha). El conectivo entre A6 y A5 o otro segmento más anterior se puede utilizar. </li><li> Ajuste el electrodo de succión de grabación para que pueda pull una conjuntivo cortado en el electrodo. Asegúrese de tirar un poco de solución salina en los electrodos de succión para cubrir el alambre de plata en su interior antes de chupar en los nervios. Asegúrese de que el electrodo de estimulación también se basa en la solución salina baño (en el abdomen cerca A3 es ideal). </li><li> Entregar una serie de estímulos individuales de aumento de la tensión hasta que aparezca un potencial de acción en la pantalla. Hay que hacer un registro de la tensión estimulante mínima y duración de reclutar una respuesta. Aumentar la intensidad hasta que se observe una respuesta sináptica en las conectivas. El gran pico (puntos de acceso extracelulares) de los axones gigantes aparece primero, y luego otra más pequeña de AP también se puede observar. </li></ol>

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Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Una de las razones para la exposición de técnicas para esta preparación clásica es que el sistema de cercos ha sido y sigue siendo un área activa de investigación en el tratamiento de las cuestiones de desarrollo de circuitos neuronales, así como cuestiones relativas a la reparación sináptica y regeneración 26-31. Cualquiera de los métodos de evocar la actividad en el cordón nervioso ventral cucaracha puede ser utilizado para examinar los efectos de los agentes farmacológicos o insecticidas en la función del sistema nervioso. Estos experimentos se realizan por simple disolución de productos químicos neuroactivos en solución salina. Después de intercambiar esta solución con el medio baño normal, cambios en la actividad evocada o espontánea se pueden observar durante la grabación de conectivas o un nervio motor para dar una lectura coherente de los efectos del producto químico sobre la función del SNC. Como en todos los experimentos neurofisiológicos un problema común es el ruido eléctrico. Probablemente el mayor factor en la calidad de señal para estos preparados is el sello electrodo de succión en el tejido nervioso. Un sello hermético que no llama por completo en el nervio cercal o conectivo es ideal. Las grabaciones también se pueden hacer con electrodos de gancho doble colocados bajo el cordón nervioso y el aislamiento de la VNC con una mezcla de aceite mineral y vaselina. La mezcla se puede cargar en una jeringa y expulsado alrededor del cordón del nervio 32. También una disección cuidadosa es tan crítico aquí como en cualquier preparación del SNC. Algunos pueden encontrar más fácil el acceso al SNC mediante la disección de la cutícula dorsal. Mientras que esto reduce la posibilidad de dañar el cordón nervioso ventral puede ser más difícil de eliminar todas las vísceras utilizando este enfoque. No se describe aquí, pero esta preparación es susceptible de registro intracelular en las interneuronas gigantes 32,33. El cordón nervioso entero también se puede quitar para acomodar varios electrodos de registro y estimulante al mismo tiempo. De hecho la exploración del lóbulo antenal, bo setasdy, y otras estructuras del SNC anterior está todavía en curso 34-35. Mientras que la cucaracha CNS sigue arrojar luz sobre la investigación neurobiológica moderna esta preparación particular es lo suficientemente simple para ser utilizado en laboratorios académicos de pregrado.

Hay más de 4.000 especies de cucarachas, pero sólo alrededor del 30 son plagas domésticas. Tal vez el más reconocido es el mal llamado cucaracha americana Periplaneta americana que se originó en África, y ahora se encuentra en casi todas partes del planeta. Además de su rápida velocidad de carrera 1 y el comportamiento evasivo, en el trópico P. americana es capaz de 2,3 de vuelo. Las características predominantes del sistema nervioso central cucaracha (SNC) son su naturaleza segmentada y la descentralización del control de procesos de 4,5. El cerebro, torácica, abdominal y ganglios están unidos por conectores interganglionic emparejados para formar el cordón nervioso ventral (VNC). Los ganglios en cada segmento están integrando centros. Ellos se componen de una región exterior, cortical que contiene células responsables de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro, justo debajo de ellos, y la somas de las neuronas oriNating en que ganglio. Estos cuerpos celulares pueden pertenecer a las interneuronas, neuronas moduladoras, o neuronas motoras. Suministran axones que quedan dentro del ganglio de origen (interneuronas locales), o axones que se proyectan entre los ganglios del sistema nervioso central (interneuronas interganglionic) o que terminan en las células del músculo periférico (neuronas motoras). La mayoría de los cuerpos celulares se sitúan ventral o ventrolateralmente en la corteza ganglionar 5. Los pares, conectivas interganglionic sólo contienen axones y no hay cuerpos de células neuronales. El neuropil de un ganglio contiene células gliales (neuroglia), tractos de axones, haces de axones y dendritas, (neuritas) de las neuronas. El neuropil carece de cuerpos de células neuronales. Esta es la región en el ganglio donde ocurre la comunicación sináptica directa entre las células nerviosas y la integración de los insumos. La capacidad de la cucaracha americana P. americana de detectar y de repente responder a un depredador que se acerca (de pie, de hanD, etc.) se ha atribuido a un circuito de reflejo que consiste en la Cerci y 6,7 gigante sistema de fibra. Los cercos son un par de estructuras sensibles al viento como cuernos situados en el extremo del abdomen (Figura 1). En P. americana de la superficie ventral de cada cercus contiene alrededor de 200 filiformes (rosca) pelos que se organizan en 14 columnas. Nueve de estas columnas se pueden identificar de forma consistente en diferentes animales de acuerdo con las propiedades de respuesta de la célula asociada al receptor y el axón. Cada pelo está en un zócalo que permite que se doble más fácilmente en un plano que es específico de la columna. Movimiento del pelo en una dirección a lo largo de su plano induce una despolarización en la célula receptora y una ráfaga de potenciales de acción (AP) en la neurona sensorial. El movimiento en la dirección opuesta inhibe cualquier APs espontáneos en curso 8. El plano preferido de deflexión y la direccionalidad de la respuesta es diferente en cada columna. Por lo tanto, la filiforcomplejos m pelo de los receptores son responsables no sólo de detectar el movimiento del aire, sino también para &#39;codificar&#39;, en forma de puntos de acceso, la dirección desde la que se originó la corriente de aire. El procesamiento de esta información por parte del SNC da como resultado una &quot;apropiada&quot; respuesta de escape 6,7. Esta especificidad funcional, columnar de los pelos sensoriales se conserva de animal a animal. La célula receptora de cada pelo filiforme es responsable de la transducción de la deflexión mecánica del cabello en un evento neuronal (que resulta en una explosión o la inhibición de los puntos de acceso en el axón de la célula del receptor 9. Los puntos de acceso viajan al ganglio abdominal terminal (A6) a través de cercal XI nervio, donde hacen sinapsis con los axones gigantes del cordón nervioso ventral (VNC). Los axones gigantes se cree que son responsables de la transmisión y la posterior excitación de las neuronas motoras que se traduce en un comportamiento de escape 6,10,11. La latencia de comportamiento Of la respuesta de escape de P. americana es uno de los más cortos de cualquier animal 7. Latencia del comportamiento es el tiempo entre la llegada de un estímulo a un mecano y la iniciación de una respuesta de escape. En experimentos con la cinematografía de alta velocidad para registrar el intento de fuga de un sapo de atacar, se observó la cucaracha para comenzar su vez lejos del sapo en unos 40 ms (tiempo de comienzo de extensión lengua para cucarachas movimiento 7,12. Usando bocanadas de viento controladas , la latencia de comportamiento se podría reducir a 11 mseg. Otros experimentos revelaron que una velocidad de soplo de viento mínima de 12 mm / ms (con una aceleración de 600 mm / mseg 2) puede evocar una respuesta de escape, mientras que las velocidades aún más bajos (3 mm / seg) causada cucarachas para detener móvil de 12 caminando lentamente. La fuerte correlación que normalmente existe entre los sistemas de fibras gigantes y comportamiento de escape ha sido bien documentada 13,14. En instances donde es necesario y suficiente para evocar un comportamiento en particular una célula particular, la célula se conoce como una neurona del sistema 15,16. Interneuronas gigantes (IG) en el circuito de escape viento de P. americana no son necesarios para el reflejo. Los animales que han ablacionadas experimentalmente IG todavía exhiben el comportamiento de escape, por tanto, estos soldados no se consideran las neuronas comando 17,18. La ruptura de conectivas cervicales que son rostral al circuito sensoriomotor también influye en el comportamiento, lo que indica que la entrada descendente desde el cerebro tiene un efecto en la dirección de escape 19. Estos aspectos de un control preciso y la redundancia son de suma importancia para la supervivencia del organismo y se complementan con la modulación neuroquímica mediante aminas biógenas 20. El P. preparación cordón nervioso americana ha sido un modelo de sistema elegante para neuroethologists durante las últimas décadas a partir de los trabajos pioneros de Roeder &lt;sup&gt; 21. Se permite a los estudiantes para registrar, mostrar y analizar la actividad sensorial primaria y las respuestas resultantes de las interneuronas gigantes para su 22,23,24 entrada. Además de transmitir la idea de que los circuitos neuronales identificables subyacen a las respuestas de comportamiento en el medio ambiente, estos ejercicios deberían inculcar el aprecio por las contribuciones biológicas realizadas por esta plaga común de la casa.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

La preparación cordón nervioso ventral cucaracha es un sistema manejable para experimentos neuroetología, modelado de redes neuronales, y probar los efectos fisiológicos de los insecticidas. Este artículo describe el alcance de las modalidades sensoriales de cucarachas que se pueden utilizar para someter a ensayo cómo un sistema nervioso de los insectos responde a las perturbaciones ambientales. El énfasis aquí está en la conducta de escape mediada por cercos de transmisión de fibra gigante en Periplaneta americana. Esta preparación in situ sólo requiere de habilidad y experiencia de disección moderada electrofisiológico para generar grabaciones reproducibles de la actividad neuronal. Los péptidos u otros reactivos químicos a continuación, se pueden aplicar directamente al sistema nervioso en solución con la solución salina fisiológica. Los insecticidas también pueden ser administradas antes de la disección y el circuito de escape pueden servir como un proxy para el estado excitable del sistema nervioso central. En este contexto, los ensayos descritos en el presente documento también serían útiles para ros investigadores interesados ​​en la regeneración de las extremidades y la evolución del desarrollo del sistema nervioso para que P. americana es un organismo modelo establecido.

La estimulación de los pelos de la cercos por una bocanada de aire hace que las descargas de las neuronas sensoriales primarias que se pueden grabar usando electrodos de aspiración extracelular conectados ya sea a conectivas entre ganglios abdominales o el propio nervio cercal (Figura 8). Amplitudes de Spike grabadas de las dos regiones están en el orden de varios micro-voltios a milivoltios. Debido a la integración sensorial en el ganglio de la cantidad de picos observados en el potencial de acción compuesto o como picos individuales grabadas desde el nervio cercal es notablemente mayor que la observada en las grabaciones de las conectivas. Sin embargo también en cuenta que no es sustancialmente menor ruido en la grabación en el conectivo debido al sello más apretado entre el electrodo y el tejido nervioso. Por soplar aire a los grandes picos Cerci se puede observar en las conectivas (Figura 8A). El uso de este método estimulante, grabaciones entre A3 y A4 típica<html> ly mostrar una gran característica pico del interneuronas gigantes (s). Grabación desde un nervio cercal mientras físicamente frotando la cercos con pinzas produjo una fuerte busto de actividad (Figura 8B 1). En otra grabación, 2 bocanadas de aire cada produjeron una respuesta rápida que revienta en el nervio cercal (Figura 8B 2). Cuando se estimula eléctricamente el nervio cercal con un electrodo de succión y la grabación en el conectivo entre A3 y A4, se puede observar un umbral en la estimulación de respuestas evocadas (Figura 8C 1). La estimulación eléctrica del nervio cercal provoca claramente una respuesta en términos de enlace que se puede cuantificar para los estudios de manipulación con agentes farmacológicos o rodea el local del medio ambiente, como la temperatura (Figura 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Periplaneta americana con cercos intacta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Figura 2. Vista ventral del cordón nervioso de cucarachas como se ve con la cutícula ventral eliminado (A). Una vista ampliada del segmento se indica por las flechas se ve en (B). En (C) las conectivas se derramaron entre A4 y A3 con una sonda de vidrio. El ganglio abdominal 6 ª se muestra en (D) con los dos nervios Cercal dejando en el extremo caudal. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Figura 3. Vista ventral esquemática del cordón nervioso cucaracha. YS &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Figura 4. Los cercos se colocan hacia arriba fuera del baño de solución salina. Los abdomen abiertos pueden ser inundadas con solución salina (A) con el extremo caudal de la cucaracha de ser elevado con una pequeña pieza en forma de cuña de elastómero de silicona con el fin de mantener la cercos cabo del baño (B). <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Figura 5. La 6 ª ganglio abdominal con el nervio cercal (que se señala con flechas). <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Figura 6. El equipo configurado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la lar</a>figura ger. <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Figura 7. Estimulante e electrodo de registro establecidos. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Figura 8. Grabaciones neurales de los conectivos y el nervio cercal con diversos procedimientos de estimulación. Grabación con un electrodo de succión de las conectivas entre A3 y A4, mientras que soplar aire en la Cerci (A). Grabación de las neuronas Cercal primarias con un electrodo de succión mientras sea físicamente frotando (B 1) o la prestación de bocanadas de aire (B 2) resulta en explosiones rápidas de la actividad en el nervio cercal. La estimulación eléctrica del nervio cercal produce respuestas en conectivas ( <strong&gt; C 1). Tenga en cuenta el aumento gradual de la intensidad de la estimulación (las flechas indican la amplitud de la artefacto estimulante) y la intensidad de las siguientes respuestas evocadas. La estimulación eléctrica del nervio cercal proporciona un medio relativamente más controladas de estimular el nervio cercal para la consistencia en la estimulación para la cuantificación de las respuestas (C 2).

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Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

En este artículo se describe la disección cordón nervioso ventral cucaracha y grabaciones extracelulares del nervio cercal y conectivas. Respuestas evocadas se generan por la estimulación eléctrica del nervio cercal o estimulación mecánica directa de la Cerci.

Neural Circuito de grabación de una cucaracha sistema nervioso intacto

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K vistas.  University of Kentucky.  En este artículo se describe la disección cordón nervioso ventral cucaracha y grabaciones extracelulares del nervio cercal y conectivas. Respuestas evocadas se generan por la estimulación eléctrica del nervio cercal o estimulación mecánica directa de la Cerci. 

Video: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Trasplante de progenitores interneuronas corticales de ingeniería química en cerebros de ratón postnatal temprano

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.