InDevR riconosce NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 per il finanziamento di tale opera.

1. Esempio di amplificazione con RT-PCR <ol><li> Estrarre l&#39;RNA virale da materiale clinico o da un isolato virale del virus usando il kit Qiagen MinElute Spin in collaborazione con il QIAcube piattaforma automatizzata estrazione degli acidi nucleici. Estrazioni vengono effettuate su 200 campioni microlitri con un volume di eluizione finale di 60 microlitri. Estratti di conservare a -70 ° C o inferiore per un uso successivo. </li><li> In un modello free-zona, preparare la RT-PCR master mix su ghiaccio secondo il protocollo del produttore. Per incorporare biotina Durante la RT-PCR, utilizzare una miscela biotinilati dNTP al posto del produttore fornito mix di dNTP. Il costo di utilizzo di una miscela biotinilato dNTP è meno di $ 1 USD / test. Metodi alternativi di incorporazione biotina come l&#39;uso di un primer biotinilato può anche essere usato. Aggiungi fondo mescola a concentrazioni finale di 1,0 mM per l&#39;influenza A, 1,0 mM per B Flu, e 0,14 mM per il controllo interno. L&#39;influenza Un insieme Primer amplifica il segmento gene matrice (1032 prodotto nt) e l&#39;influenza di fondo B amplifica un non-strutturali del segmento genico (811 prodotti nt). Ogni set fondo FluChip contiene un fondo con un 5 &#39;gruppo fosforil per facilitare la generazione di DNA a singolo filamento tramite digestione enzimatica con esonucleasi lambda dopo PCR. Il prodotto risultante singolo filamento richiede tempi molto più brevi di ibridazione o superiore al controvalore a doppio filamento e riduce significativamente il tempo complessivo di analisi. Un pre-preparato miscela di questi primer e il modello di controllo interno RNA sono disponibili da InDevR ai ricercatori interessati su una base limitata. </li><li> Mescolare brevemente nel vortex e distribuire 18 l di mix master in tubi con pareti sottili PCR. </li><li> Trasferimento tubi sul ghiaccio ad un&#39;area di lavoro più adatto per modello e modello di aggiungere 2 microlitri di ciascun tubo di reazione. </li><li> Trasferimento provette PCR ad un termociclatore ed eseguire il seguente profilo termico: la trascrizione inversa a 50 ° C per 30 minuti, l&#39;inattivazione dell&#39;enzima / attivazione a 95 ° C per 15 min, 40 cicli di PCR di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 secondi e 72 ° C per 1 min, ed una estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li></ol> 2. Ibridazione di RT-PCR prodotti microarray a bassa densità <ol><li> Al fine di generare DNA a singolo filamento per l&#39;ibridazione FluChip, preparare la miscela digestione enzimatica, combinando 1,0 microlitri enzima esonucleasi lambda, 2,2 l di buffer di reazione di accompagnamento, e 0,8 l di acqua priva di nucleasi. Tali importi si riferiscono a un singolo campione, ma può essere semplicemente scalati per il numero totale di campioni per essere digerito. Rimuovere campioni dal termociclatore e aggiungere 4 ml di miscela pronta a ogni reazione a digerire il filone fosforilata del prodotto della PCR. Ritorna campioni al termociclatore e programmare il termociclatore a 37 ° C per 15 minuti seguita da 95 gradi Celsius per 10 minuti per completare la digestione enzimatica e passi la frammentazione di calore. </li><li> I microarray influenza personalizzati utilizzati sono stampati su lastre di vetro aldeide funzionalizzati da Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5&#39;-amino sequenze di acquisizione terminato sono combinati con un tampone ottimizzato spotting e stampati ad una concentrazione finale di 20 mM (tranne che per la sequenza di controllo positivo, che ha inoltre un 3&#39;-biotina modifica e viene avvistato a una concentrazione finale di 500 nM) . Un non-contatto spotting metodo viene utilizzato, con un diametro dello spot ottimale di 300 micron e il centro a passo centro di 700 micron. </li><li> Rimuovere microarray dalla casella di stoccaggio e applicare monouso pozzi ibridazione in tutto il microarray rimuovendo il foglio protettivo e premendo con decisione intorno al perimetro bene. </li><li> Collocare i vetrini in un bidone lavare contenente 110 ml di acqua purificata per un min 5 pre-ibridazione lavare con un agitatore orbitale a 60-90 giri al minuto. Asciugare la matrice delicatamente toccando un tergicristallo tessuto al bordo del pozzo e permettendo all&#39;acqua di essere malvagio distanza. </li><li> Unire 22 ml di tampone di ibridazione 2x con ciascuno dei prodotti frammentato ssDNA, e pipetta 40 ml di soluzioni di ibridazione nei pozzetti microarray. </li><li> Permettere che i vetrini a ibridare in camera umida chiuso per 60 minuti. </li><li> Rimuovere i vetrini dalla camera di umidità, brevemente risciacquare array con tampone di lavaggio D in un risciacquo bottiglia prima di inserire nel rack di diapositive. Di solito il volume di risciacquo di tampone di lavaggio D è di 2 ml per array. Luogo cremagliera diapositiva contenente le diapositive di bin lavare contenente 110 ml di Wash Buffer bin A. Mettere su agitatore orbitale a 60-90 rpm per 1 minuto. </li><li> Rimuovere il rack di scivolare dal tampone di lavaggio A, brevemente risciacquare con tampone di lavaggio D, far scorrere cremagliera trasferimento in un bidone contenente tampone di lavaggio B, e si agita a 60-90 rpm per 5 minuti. </li><li> Asciugare delicatamente l&#39;array in ogni diapositiva, e il luogo diapositive essiccato in camera umida in preparazione ampliPHOX fasi di rilevamento colorimetrico. </li></ol> 3. ampliPHOX: etichettatura dei prodotti ibridato e patatine calibrazione con ampliTAG <ol><li> Combinare<html> 10 ml di ampliTAG, 20 ml di tampone ampliTAG 2x, e 10 ml di acqua purificata per ogni array da elaborare. I volumi dei reagenti possono essere semplicemente scalati per il numero totale di campioni. Assicurarsi di preparare impasto abbastanza etichettatura per tenere conto di tutti gli array campione e gli array di taratura necessarie. Il numero di chip di taratura necessarie dipende dal fatto che si sta eseguendo una calibrazione completa (per uno strumento nuovo o nuovo lotto di reagenti), o semplicemente un controllo dello strumento. Per una calibrazione completa, 3 chip di taratura devono essere etichettati, e per un controllo reattivo, solo un singolo chip di taratura devono essere etichettati. Si prega di notare che prima della calibrazione array vengono etichettati, devono passare attraverso la pre-ibridazione fase di lavaggio che è stato precedentemente descritto per gli array influenza. </li><li> Trasferire 40 ml di miscela etichetta per ciascuna matrice e consentono l&#39;uso di reazione di procedere in una camera umida chiuso per 5 minuti. </li><li> Sciacquare immediatamente gli array con tampone di lavaggio D in un risciacquo bottiglia prima di mettere le diapositive in un rack di diapositive. Trasferimento cremagliera in bin contenente 110 ml di tampone di lavaggio C, e agitare a 60-90 rpm per 5 minuti. </li><li> Utilizzando un secondo bidone lavare con acqua purificata, eseguire tre cadute consecutive acqua breve per rimuovere i residui di sale. Secco gli array delicatamente toccando un tergicristallo tessuto al bordo dei pozzetti. </li><li> I microarray sono ora correttamente etichettati con ampliTAG, e il resto della procedura di rilevamento ampliPHOX può essere eseguita. Fotoattivazione e l&#39;imaging di array etichetta dovrebbe essere completato entro 24 ore, e gli array aggiuntivi possono essere memorizzati in una scatola buia scivolare fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. ampliPHOX: calibrazione, amplificazione del segnale, e di imaging <ol><li> Girare ampliPHOX lettore e verificare ampliVIEW software è pronto per fotoattivazione. </li><li> Determinare il momento ottimale fotoattivazione utilizzando chip di calibrazione. In aggiunta alla breve introduzione che segue, questa procedura è descritta dettagliatamente nel manuale d&#39;uso ampliPHOX. I chip di calibrazione contiene una serie di diluizioni di una sequenza di controllo biotinilato che vengono utilizzati per ottimizzare la sensibilità del test, con l&#39;obiettivo di massimizzare il numero di righe del chip di calibrazione che producono un segnale positivo, come determinato dal software. </li><li> Rimuovere ampliPHY da 4 ° C, permettono di riscaldare a temperatura ambiente, e vortice brevemente per mescolare. Pipettare 3 ml di ampliPHY enhancer nel flaconcino ampliPHY, e vortice a fondo per 10 secondi. </li><li> Uniformemente trasferimento 40 ml di soluzione ampliPHY nel microarray contenente il bene ampliTAG marcato array, assicurando che non siano presenti bolle. Chiudere la fiala ampliPHY tra ogni applicazione. Inserire il vetrino microarray nella baia fotoattivazione del lettore ampliPHOX. </li><li> Per l&#39;array prima calibrazione, utilizzare il tempo fotoattivazione predefinito nella casella &#39;Time&#39; sul pannello sinistro del software, e fare clic sul pulsante verde &#39;Start&#39; per avviare il fotoattivazione. Una volta completato, rimuovere l&#39;array e sciacquare con acqua purificata per rimuovere ampliPHY in eccesso. Chiara la formazione di polimeri in alcuni dei luoghi dovrebbe essere visibile. </li><li> Lasciare i punti polimero ad asciugare per 2 minuti, quindi distribuire due gocce di ampliRED sul array e colorazione permettono di procedere per 2 minuti. </li><li> Poi, rapidamente microarray risciacquare con acqua purificata e asciugare con un tessuto pulire. </li><li> Inserire microarray nella baia di imaging del lettore ampliPHOX, e clicca sul pulsante &#39;Image Capture Nuovo&#39; nella scheda Imaging. Una volta ripreso, regolare il raccolto e salvare l&#39;immagine. </li><li> Nella scheda di analisi, selezionare la maschera Chip di calibrazione e il pulsante &#39;Placement Auto&#39; per avviare l&#39;analisi. Il software produrrà automaticamente un &#39;resoconto sommario&#39; che mostra i risultati quantificati. Sulla base di questi risultati, il tempo fotoattivazione è regolata da 10 secondi per la matrice di calibrazione secondo, e il procedimento viene ripetuto. </li><li> Una volta che il tempo fotoattivazione ottimale è stato determinato, gli array campione può essere elaborati utilizzando l&#39;amplificazione del segnale e lo stesso protocollo di imaging utilizzata per la calibrazione array. </li><li> Una volta che l&#39;immagine viene acquisita per gli array campione, una maschera per il layout matrice particolare, come la struttura del sistema influenza qui descritto può essere created.The ampliVIEW software è in grado di eseguire l&#39;analisi automatizzata delle immagini e generare risultati dell&#39;influenza sottotipizzazione per ogni campione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Illustrazione schematica del metodo di rilevazione ampliPHOX colorimetrico. (A) DNA bersaglio biotinilato è ibridato da ogni punto della matrice, e (B) marcato con ampliTAG. (C) soluzione ampliPHY è poi aggiunto, e (D) esposti alla luce per formare macchie polimero visibile. (E) Gli spot polimero formato vengono successivamente tinto con un colorante non tossico per migliorare il contrasto. CONTENUTO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) influenza il layout microarray a bassa densità. Sequenze di 1-7 e 10-13 influenza bersaglio A, e le sequenze di 8, 9 bersaglio il virus dell&#39;influenza B. (B) ampliPHOX e (C) immagini di fluorescenza di un romanzo H1N1 2009 (&#39;influenza suina&#39;) del campione che mostra lo stesso modello di rilevazione sia metodi. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Da sinistra a destra, immagini rappresentative ampliPHOX per l&#39;influenza A H3N2, di origine umana H1N1, 2009 H1N1 (di origine suina), e un campione negativo. Tutti e 3 i sottotipi di mostrare visivamente i modelli distinti sulla matrice. Si noti che in senso negativo solo il controllo interno MS2 è visto, indicando la RT-PCR l&#39;amplificazione non è stato inibito.

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	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarrays+in+the+clinic:+infectious+diseases.">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li><li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays.">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li><li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology.">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li><li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MChip:+A+Single+Gene+Diagnostic+for+Influenza+A.">MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A.</a> Influenza: Molecular Virology. , (2010).</li><li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray.">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li><li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluChip:+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray.">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li><li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays.">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li><li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip,+a+three-dimensional+biochip,+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses.">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li><li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays.">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li><li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays.">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li><li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di InDevR, Inc., una scopo di lucro. InDevR sta commercializzando la tecnologia ampliPHOX qui descritti.

La rilevazione ampliPHOX colorimetrico tecnologia qui presentata è una rapida, alternativa economica alla rilevazione unico colore a fluorescenza per applicazioni a bassa densità microarray. Mostrato schematicamente nella Figura 1, il principio di rilevazione si basa sull&#39;utilizzo di una etichetta fotoiniziatore (1B). In presenza di un monomero contenente soluzione (1C), l&#39;esposizione alla luce fa sì che il fotoiniziatore (ampliTAG) per innescare una reazione di polimerizzazione solo nelle re...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / attrezzature </th><th> Fabbricante </th><th> Catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Virus Kit Spin </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> singola 60 microlitri di eluizione </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> opzionale </td></tr><tr><td> ABI 9800 Veloce termociclatore </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> Kit dNTP non utilizzato </td></tr><tr><td> 2x Buffer Spotting </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda esonucleasi </td><td> Epicentre Biotecnologie </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip fondo mix </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> non sono ancora disponibili per la vendita </td></tr><tr><td> Shaker orbitale </td><td> Madell Tecnologia </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Rack </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione buffer 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Calibrazione Chips </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Buffer dC </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA microarray sono emerse come un potente strumento per la rilevazione di agenti patogeni. 1-5 Per esempio, molti esempi della capacità di tipo e sottotipo di virus influenzale sono stati dimostrati. 6-11 L&#39;identificazione e la tipizzazione di influenza sul DNA microarray ha applicazioni sia in pubblico salute e la clinica per la diagnosi precoce, l&#39;intervento rapido, e riducendo al minimo l&#39;impatto di una pandemia influenzale. Fluorescenza tradizionale è attualmente il più utilizzato metodo di rilevamento microarray. Tuttavia, come la tecnologia dei microarray progredisce verso l&#39;uso clinico, 1 sostituzione di strumentazione costosa tecnologia di rilevamento a basso costo che presentano caratteristiche di prestazioni simili a fluorescenza renderà saggi microarray più attraente e conveniente. La rilevazione ampliPHOX colorimetrico di tecnologia destinata ad applicazioni di ricerca, ed ha un limite di rilevazione all&#39;interno di un ordine di grandezza dei tradizionali fluorescenza 11, con un vantaggio principale è un approssimativo costo dieci volte inferiore rispetto a strumento del microarray scanner confocale necessari per fluorescenza microarray rilevamento. Un altro vantaggio è la compattezza dello strumento che consente la portabilità e flessibilità, a differenza dei tradizionali strumenti di fluorescenza. Perché la tecnologia di polimerizzazione non è così intrinsecamente lineare come rivelazione a fluorescenza, tuttavia, è più adatto per le applicazioni di densità più bassa microarray, in cui è desiderato un sì / no risposta per la presenza di una certa sequenza, come per gli array di rilevazione degli agenti patogeni. Attualmente la densità del punto massimo compatibile con la rilevazione ampliPHOX è ~ 1800 punti / array. A causa delle limitazioni densità posto, microarrays ad alta densità non sono adatti per il rilevamento ampliPHOX. Qui, vi presentiamo la tecnologia di rilevamento colorimetrico ampliPHOX come metodo di amplificazione del segnale su un microarray a bassa densità sviluppato per la rilevazione e la caratterizzazione dei virus influenzali (FluChip). Anche se questo protocollo utilizza il FluChip (un DNA microarray) come una specifica applicazione di ampliPHOX rilevazione, ogni microarray incorporando obiettivo biotinilato possono essere etichettati e rilevati in modo analogo. Il design microarray e biotinilazione del bersaglio da catturare sono sotto la responsabilità dell&#39;utente. Una volta che il bersaglio biotinilato è stato catturato sulla matrice, il rilevamento ampliPHOX può essere eseguito da tagging primo array con un coniugato streptavidina-label (ampliTAG). Su esposizione alla luce di usare lo strumento ampliPHOX Reader, polimerizzazione di una soluzione di monomero (ampliPHY) si verifica solo nelle regioni contenenti ampliTAG marcato obiettivi. Il polimero formato può essere successivamente colorato con un non-tossico soluzione per migliorare il contrasto visivo, seguita da immagini e analisi utilizzando un semplice pacchetto di software (ampliVIEW). Il test FluChip intero da un-estratto campione risultato può essere eseguita in circa 6 ore, e le fasi di rilevamento ampliPHOX descritto sopra può essere completata in circa 30 min.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un&#39;alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.

ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l&#39;influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  InDevR Inc.. ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un'alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...