InDevR reconhece NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 para financiamento deste trabalho.

1. Ampliação da amostra utilizando RT-PCR <ol><li> Extrato de RNA viral a partir de material clínico ou de um isolado viral utilizando o Kit Qiagen MinElute rotação de vírus em conjunto com a plataforma de extração de ácidos nucleicos QIAcube automatizado. Extrações são realizadas em 200 mL de amostra com um volume de eluição final de 60 mL. Extratos armazenar a -70 ° C ou menor para uso posterior. </li><li> Em um modelo de área de livre, prepare o RT-PCR Master Mix no gelo acordo com o protocolo do fabricante. Para incorporar biotina durante a RT-PCR, use uma mistura dNTP biotinilado no lugar do fabricante fornecido mix dNTP. O custo de usar uma mistura dNTP biotinilado é menos de $ 1 USD ensaio /. Métodos alternativos de incorporação biotina, como a utilização de um primer biotinilado também pode ser usado. Adicionar cartilha misturas em concentrações finais de 1,0 mM para a Gripe A, B 1,0 M para Flu, e 0,14 mM para o controle interno. O Flu Um conjunto de primers amplifica o segmento de gene de matriz (1032 nt produto) eo conjunto de primers Flu B amplifica um segmento de gene não-estruturais (811 produto nt). Cada conjunto contém uma cartilha FluChip cartilha com um 5 &#39;grupo fosforil para facilitar a geração de DNA de fita única via digestão enzimática com exonuclease lambda seguintes PCR. O produto resultante de fita simples requer tempos de hibridização muito menor do que o equivalente dupla fita e reduz significativamente o tempo de ensaio geral. Uma mistura pré-preparada de estes primers, bem como o modelo de RNA de controles internos estão disponíveis a partir InDevR para os pesquisadores interessados ​​em uma base limitada. </li><li> Brevemente vortex e distribuir 18 mL da mistura de mestre em tubos de paredes finas PCR. </li><li> Transferência de tubos no gelo a uma área de trabalho adequado para além do modelo, e adicionar 2 mL para cada modelo de tubo de reação. </li><li> Tubos de transferência de PCR para um termociclador e executar o seguinte perfil térmico: transcrição reversa a 50 ° C por 30 min, a inativação da enzima / ativação de 95 ° C por 15 min, 40 ciclos de PCR de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30s e 72 ° C por 1 min, e uma extensão final a 72 ° C por 10 min. </li></ol> 2. Hibridação de RT-PCR produtos para microarrays de baixa densidade <ol><li> A fim de gerar DNA de fita simples para a hibridização FluChip, prepare a mistura de digestão enzimática através da combinação de 1,0 mL da enzima exonuclease lambda, 2.2 l do tampão de reação de acompanhamento, e 0,8 mL de água livre de nuclease. Estes montantes são para uma única amostra, mas pode ser simplesmente escalado para o número total de amostras a serem digeridas. Remover amostras do termociclador e adicionar 4 mL da mistura preparada para cada reação de digerir a vertente fosforilada do produto da PCR. Retorno de amostras para o termociclador e programar o termociclador a 37 graus Celsius por 15 minutos seguido de 95 graus Celsius por 10 minutos para completar a digestão enzimática e fragmentação passos calor. </li><li> Os microarrays influenza personalizados usados ​​são impressas em lâminas de vidro aldeído funcionalizado pela Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5&#39;-amino capturar seqüências terminadas são combinados com um buffer otimizado spotting e impresso em uma concentração final de 20 mM (exceto para a sequência do controlo positivo, que além disso tem uma modificação 3&#39;-biotina e é avistado em uma concentração final de 500 nM) . Um contato não-spotting método é usado, com um diâmetro do ponto ideal de 300 mm, e centro para lançar centro de 700 mM. </li><li> Remover microarrays da caixa de armazenamento e aplicar poços de uso único de hibridização em todo o microarrays, removendo a folha de protecção e pressionando firmemente em torno do perímetro bem. </li><li> Colocar as lâminas em uma lata de lavagem contendo 110 ml de água purificada para a 5 min de lavagem pré-hibridização utilizando um agitador orbital de 60-90 rpm. Secar a matriz, tocando suavemente um limpador de tecido até a borda do poço e permitindo que a água a ser mau de distância. </li><li> Combine 22 mL de tampão de hibridação 2x com cada um dos produtos fragmentados ssDNA e Pipete 40 das soluções de hibridização nos poços microarray. </li><li> Permitir slides de hibridizar em câmara húmida fechada por 60 minutos. </li><li> Remove os slides da câmara de umidade, brevemente lavar matrizes com Wash Buffer D em uma garrafa lavar antes de colocar no rack de slides. Normalmente o volume de lavagem de Wash Buffer D é de 2 ml por matriz. Rack de lugar slide contendo slides no bin lavar contendo 110 ml Tampão bin A. Coloque em agitador orbital de 60-90 rpm durante 1 minuto. </li><li> Remover porta-lâminas de tampão de lavagem A, brevemente enxaguar com Wash Buffer D, rack de transferência de slide para uma caixa contendo B tampão de lavagem, e agitar a 60-90 rpm por 5 minutos. </li><li> Seque suavemente a matriz em cada slide, slides e colocar secas em câmara de umidade, em preparação para as etapas de detecção de ampliPHOX colorimétrico. </li></ol> 3. ampliPHOX: rotulagem dos produtos cruzados e fichas de calibração com ampliTAG <ol><li> Combinar<html> 10 ml de ampliTAG, 20 l de tampão ampliTAG 2x, e 10 ml de água purificada para cada matriz para ser processado. Os volumes de reagente podem ser simplesmente dimensionados para o número total de amostras. Certifique-se de preparar a mistura rotulagem suficientes para explicar todas as matrizes de amostra e matrizes de calibração necessário. O número de chips de aferimento depende se você estiver executando uma calibração completa (para um instrumento novo ou novo lote de reagentes), ou apenas uma verificação de instrumento. Para uma calibração completa, 3 chips de calibração devem ser rotulados, e para uma verificação de reagentes, apenas um chip único de calibração devem ser rotulados. Por favor, note que antes de as matrizes de calibração são rotulados, eles devem passar pela etapa de lavagem pré-hibridação que foi descrito anteriormente para as matrizes de influenza. </li><li> Transferir 40 mL da mistura de etiqueta para cada matriz e permitir a rotulagem de reação para avançar em uma câmara de umidade fechado por 5 minutos. </li><li> Lave imediatamente matrizes com Wash Buffer D em uma garrafa de lavar antes de colocar slides em um rack de slide. Transferência de rack na bin contendo 110 ml de Tampão C, e agitar a 60-90 rpm por 5 minutos. </li><li> Usando um bin segunda lavagem com água purificada, execute três vezes consecutivas quedas de água breve para remover os resíduos de sal. Seca as matrizes por tocar suavemente um limpador de tecido para a beira dos poços. </li><li> Os microarrays estão devidamente rotulados com ampliTAG, eo restante do procedimento de detecção ampliPHOX pode ser realizada. Fotoativação e de imagem de matrizes com a etiqueta deve ser concluída no prazo de 24 horas, e arrays adicionais podem ser armazenados em uma caixa de lâminas escuras até o uso. </li></ol> 4. ampliPHOX: calibração, amplificação de sinal e imagem <ol><li> Por sua vez ampliPHOX leitor sobre software e garantir ampliVIEW está pronto para fotoativação. </li><li> Determinar o tempo de fotoativação ideal o uso de chips de calibração. Além da breve introdução que se segue, este procedimento também é descrito em detalhe no Manual de Operação ampliPHOX. Os chips de calibração contém uma série de diluições de uma seqüência de controle biotinilado que são utilizados para otimizar a sensibilidade do ensaio, com o objetivo de maximizar o número de linhas do chip de calibração que produzem um sinal positivo, conforme determinado pelo software. </li><li> Remover ampliPHY de 4 ° C, permitem a temperatura ambiente, e vortex brevemente para misturar. Pipete 3 de ampliPHY enhancer no frasco ampliPHY e vortex cuidadosamente por 10 segundos. </li><li> Uniformemente transferir 40 ml de solução ampliPHY para o bem microarray contendo o ampliTAG marcado matriz, garantindo que nenhum bolhas estão presentes. Fechar o frasco ampliPHY entre cada aplicação. Inserir o slide microarray na baía fotoativação do Leitor ampliPHOX. </li><li> Para a matriz primeira calibração, usar o tempo de fotoativação padrão no &#39;Time&#39; caixa no painel esquerdo do software, e clique no verde &#39;Start&#39; para iniciar a fotoativação. Depois de concluído, retire a matriz e enxágüe com água purificada para remover ampliPHY excesso. Formação de polímeros claras sobre alguns dos pontos deverão ser agora visíveis. </li><li> Permitir que as manchas de polímero para secar por 2 minutos, em seguida, distribua duas gotas de ampliRED para a matriz e permitir que a coloração para prosseguir por 2 minutos. </li><li> Em seguida, enxágüe rapidamente microarray com água purificada e seque com um lenço de papel. </li><li> Inserir microarray na baía de imagens do Leitor ampliPHOX, e clique no botão &#39;nova imagem de captura &quot;na guia Imagem. Uma vez digitalizado, ajustar a recortar e salvar a imagem. </li><li> Na guia de análise, selecione a máscara Chip de calibração e no botão &quot;Colocação Auto &#39;para iniciar a análise. O software vai automaticamente produzir um &#39;Record Resumo&#39; mostrando os resultados quantificados. Com base nesses resultados, o tempo de fotoativação é ajustado por 10 segundos para a matriz de calibração segundo, eo procedimento é repetido. </li><li> Uma vez que o tempo ideal fotoativação foi determinada, as matrizes de amostra podem ser processados ​​usando a amplificação de sinal mesmo e protocolo de imagem usado para as matrizes de calibração. </li><li> Depois que a imagem é capturada para as matrizes de amostra, uma máscara para o seu layout de matriz específico como o layout variedade de gripe descrito aqui pode ser created.The ampliVIEW software é capaz de realizar análise de imagem automática e gerando resultados influenza subtipagem para cada amostra. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Ilustração esquemática do método de detecção ampliPHOX colorimétrico. (A) DNA alvo biotinilado é hibridizada com cada ponto na matriz, e (B) marcada com ampliTAG. (C) ampliPHY solução é então adicionado, e (D) exposto à luz para formar manchas de polímero visível. (E) As manchas de polímero formado são posteriormente marcadas com um corante não tóxico para melhorar o contraste. ONTEÚDO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) layout da Influenza microarray de baixa densidade. Seqüências de 1-7 e 10-13 influenza A meta, e as seqüências de 8, 9 alvo influenza B. (B) ampliPHOX e (C) as imagens de fluorescência de um romance de 2009 H1N1 (&quot;gripe suína&quot;) Espécime mostrando o mesmo padrão de detecção por ambos os métodos. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Da esquerda para a direita, imagens representativas ampliPHOX para influenza A H3N2, de origem humana H1N1, 2009 romance H1N1 (suína de origem), e um espécime negativo. Todos os três subtipos mostram padrões visualmente distintas na matriz. Aviso no negativo que apenas o controle interno é visto MS2, indicando a amplificação RT-PCR não foi inibida.

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	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. 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Todos os autores são funcionários da InDevR, Inc., uma entidade com fins lucrativos. InDevR está comercializando a tecnologia ampliPHOX aqui descritos.

A tecnologia de detecção colorimétrica ampliPHOX aqui apresentada é uma alternativa rápida e barata para detecção de uma única cor de fluorescência para aplicações de menor densidade de microarray. Mostrado esquematicamente na Figura 1, o princípio de detecção é baseado no uso de uma etiqueta fotoiniciador (1B). Na presença de uma solução de monômero contendo (1C), a exposição à luz faz com que o fotoiniciador (ampliTAG) para desencadear uma reação de polimerização apenas em re...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / equipamentos </th><th> Fabricante </th><th> Catalogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Kit Qiagen MinElute rotação Virus </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> eluição 60 mL única </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> opcional </td></tr><tr><td> ABI 9800 Rápido Termociclador </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> kit dNTPs não utilizados </td></tr><tr><td> Tampão Spotting 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Mix dNTP biotinilado </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Exonuclease Lambda </td><td> Biotecnologias Epicentre </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip mistura de iniciadores </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> ainda não disponível para venda </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Madell Tecnologia </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Racks </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de hibridação 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Fichas de calibração </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Buffers AD </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA microarrays têm emergido como uma poderosa ferramenta para a detecção de patógenos. 1-5 Por exemplo, muitos exemplos da capacidade de tipo e subtipo do vírus influenza tem sido demonstrado. 6-11 A identificação e subtipos de gripe em microarrays de DNA tem aplicações tanto em público saúde e da clínica para a detecção precoce, intervenção rápida, e minimizar o impacto de uma pandemia de influenza. Fluorescência tradicional é atualmente o método de detecção mais comumente utilizados microarray. No entanto, como tecnologia de microarray progride para uso clínico, uma substituindo a instrumentação caros com tecnologia de detecção de baixo custo que apresentem características de desempenho semelhante ao de fluorescência fará ensaios de microarray mais atrativo e rentável. A tecnologia de detecção colorimétrica ampliPHOX é destinado a aplicações de pesquisa, e tem um limite de detecção dentro de uma ordem de magnitude da fluorescência tradicionais 11, com uma vantagem principal é um valor aproximado de dez vezes menor custo em comparação com o instrumento scanners microarray confocal de fluorescência necessários para microarray detecção. Outra vantagem é o tamanho compacto do instrumento que permite a portabilidade e flexibilidade, ao contrário dos tradicionais instrumentos de fluorescência. Porque a tecnologia de polimerização não é tão linear como inerentemente detecção de fluorescência, no entanto, é mais adequado para aplicações de menor densidade microarray em que um sim / não respondeu para a presença de uma determinada seqüência é desejada, como, por matrizes de detecção de patógenos. Atualmente a densidade local máxima compatível com a detecção ampliPHOX é de aproximadamente 1.800 pontos / matriz. Devido às limitações de densidade local, microarrays maior densidade não são adequados para a detecção ampliPHOX. Aqui, apresentamos ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica como um método de amplificação de sinal em um microarray de baixa densidade desenvolvido para a detecção e caracterização dos vírus influenza (FluChip). Embora este protocolo utiliza o FluChip (um microarray de DNA) como uma aplicação específica do ampliPHOX detecção, qualquer microarray incorporando-alvo biotinilado pode ser rotulada e detectado de forma similar. O projeto microarray e Biotinilação do alvo a ser capturada são de responsabilidade do usuário. Uma vez que o alvo biotinilado foi capturado na matriz, detecção ampliPHOX pode ser realizada por marcação a primeira matriz com um conjugado de estreptavidina-label (ampliTAG). Após a exposição à luz usando o instrumento ampliPHOX Leitor de polimerização, de uma solução de monômero (ampliPHY) ocorre somente em regiões contendo ampliTAG marcado alvos. O polímero formado pode ser posteriormente coradas com uma solução não tóxica para melhorar o contraste visual, seguido de imagem e análise usando um pacote de software simples (ampliVIEW). O ensaio FluChip inteira de un-extraído de amostra para resultado pode ser realizado em cerca de 6 horas, e as etapas de detecção de ampliPHOX descrito acima pode ser concluído em cerca de 30 min.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K visualizações.  InDevR Inc.. ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...