El autor desea reconocer el uso del núcleo de la Infancia del Instituto de Investigación de imágenes para la microscopía confocal y el Dr. Jian Zhang a la sugerencia de montar secciones usando perlas de agarosa. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención DC010387.

1. El aislamiento y la fijación de oído interno <ol><li> Para el análisis de los patrones celulares en el órgano de Corti, la eutanasia adecuadamente organizado de embriones o de adultos. </li><li> Diseccionar la cápsula ótica, que contiene el oído interno membranosa. En el ratón, esto se puede hacer fácilmente en embriones a embriones (E) 14,5 días de edad, en el que E0.5 es el día en que se detectó un tapón vaginal. La disección de la cápsula ótica se lleva a cabo por primera vez por la decapitación y la apertura del cráneo en la línea media. Quitar el cerebro para exponer cada oreja (Fig. 1A). Oído interno puede ser desembolsó intacta pinzas utilizando (como Dumont n º 5, fig. 1B). Si las imágenes del órgano de Corti, la extracción cuidadosa de todo el tejido neuronal y conectivo asociado con la cápsula ótica no es necesario. </li><li> Arreglar todo el oído interno por inmersión en paraformaldehído al 4% (PFA) con suave balanceo a 4 ° C durante la noche en 1,8 ml con tapón de rosca NUNC Cryo-tubo de viales, u otro recipiente de tamaño adecuado. Solución de PFA debe ser fresca en ddH 2 0, luego se almacena a -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Al día siguiente, lavar el fijador con tres cambios de fosfato 1X solución salina (PBS). Los tejidos se pueden almacenar en PBS estéril 1X durante días hasta meses hasta que esté listo para su procesamiento. De tejidos adultos, descalcificación en el 10% EDTA (0,27 M) a 4 ° C durante 5 días, seguido de un enjuague y almacenamiento en 1X PBS. </li></ol> 2. Cortar secciones vibratome <ol><li> Prepare un 4% bajo punto de fusión de agarosa en PBS 1X. Agregar bajo punto de fusión de agarosa a 1X PBS y de microondas hasta agarosa en una solución. Tenga cuidado de que la solución no burbuja más - sacar del horno de microondas periódicamente y agitar para mezclar. Mantener la solución en un baño de agua a 55 ° C hasta su utilización. </li><li> Con unas pinzas, retire el oído interno de solución de PBS 1X y la posición en la parte inferior de un molde de incrustación Pele-A-Way. Pipeta de cualquier exceso de PBS 1X del molde. Colocar el molde para cubrir el tejido con un montón de líquido 4% bajo punto de fusión de agarosa (Fig. 2A). </li><li> La posición del oído interno para el corte en el plano adecuado. He obtenido buenos secciones del órgano de Corti mediante la aproximación de la posición de la cápsula ótica, como si se hubiera dejado in situ en la cabeza y el corte en el plano transversal. Por E14.5 embriones a los adultos, la posición del oído interno para que sea visto lateralmente, con el lateral del canal semicircular visible (Fig. 2B). Ángulo en el oído interno para que la línea formada por la parte posterior de la cápsula ótica es aproximadamente en un ángulo de 45 grados desde el plano intención de seccionar (Fig. 2A, B). Cuando la cápsula ótica es visto de manera que la parte dorsal de la cápsula ótica está en la parte superior, la vuelta basal de la cóclea se encuentra en la parte inferior (punta de flecha, fig. 2B) y si el anterior semicircular canal (ASC) en la parte superior (Fig. 2B). </li><li> Agarosa pondrá a temperatura ambiente a 30 minutos. Transferencia desprendible que contiene los moldes de tejido embebido a 4 ° C hasta el momento de la sección. Si el corte se deje para el día siguiente, agregue 1X PBS para cubrir la agarosa en el molde y guardar en una caja que contiene toallas húmedas de papel empapado en 1x PBS. </li><li> Despegar el molde de plástico. Usando una hoja de afeitar, cortar una caja de agarosa que contiene el tejido del oído interno. Tenga cuidado para asegurarse de que el plano de la sección es recta y paralela al lado opuesto de la manzana, que será la superficie sobre la que está pegada al bloque de agarosa hacia abajo. Desde la agarosa no infiltrarse en el tejido, no recortar demasiado agarosa de todo el tejido, por lo que el tejido esté bien apoyada. </li><li> Utilice pegamento para unir el bloque de la superficie de corte. </li><li> Sección con un espesor de 40 a 100 micras por vibratome. Guardar las secciones en una placa de cultivo de tejidos llenos de 1X PBS, 0,1% TritonX-100. Una sección representativa a través de la espiral coclear se muestra en la figura. 2C. </li><li> El uso de fórceps para diseccionar la agarosa de los tejidos. Agarosa al no penetrar en el tejido, pero sólo se pegará a la superficie externa del oído interno. </li><li> Si lo desea, piscina de agarosa-libre, el tejido seccionado con una pipeta con una abertura de gran diámetro para evitar que corte excesivo de los tejidos. Si se realiza múltiples manchas de anticuerpos en varios tejidos diferentes secciones se pueden organizar en un 16 - o 24-así placa de cultivo de tejidos. </li></ol> 3. Anticuerpos secciones tinción vibratome Proceda con el anticuerpo mancha. Secciones de proceso en todo el montaje, que flotan libremente en la solución. A continuación se muestra un anticuerpo ejemplo el protocolo de tinción para el marcador S100 de las células de los pilares del órgano de Corti, pero el protocolo se puede utilizar para cualquier anticuerpo. Todos los lavados se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. <ol><li> En un plato de tejido multi-así la cultura, incubar de libre flotación secciones con suave balanceo en PBT (PBS 1X, 1% de albúmina de suero bovino Triton, un 0,1% X-100) durante 30 minutos. </li><li> Pipeta de solución de edad y el bloque de libre flotante secciones con suave balanceo de PBT + suero normal de cabra (NGS 50 l / 1 ml PBT) durante 30 minutos. </li><li> Pipeta de solución de edad y añadir el anticuerpo primario diluido en PBT + NGS (dilución 1:200 de la S100 en PBT + NGS). Incubar toda la noche a 4 ° C con suave balanceo. </li><li> Pipeta de solución de anticuerpo primario. Lave 3 veces, a 5 minutos. con PBT, a continuación, 4X, 30 min. con PBT. </li><li> Bloque con PBT + NGS, de 30 minutos. </li><li> Se incuba con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia (criado en cabra) diluido en PBT + NGS. Incubar toda la noche a 4 ° C, o un par de horas, RT, suave balanceo. </li><li> Pipeta de solución de anticuerpo secundario. Lave 3 veces, a 5 minutos., Entonces min 4X, 30. con PBT. </li><li> Pipeta de última PBT lavar y cambiar con las correspondientes medio de montaje acuoso que contiene una contratinción nuclear. </li></ol> 4. Secciones de montaje de diapositivas y microscopía confocal Para evitar el aplastamiento de las secciones de espesor con el cubreobjetos, al montar las distintas secciones, un espaciador debe insertarse entre los portaobjetos de microscopio y cubreobjetos los. A continuación se presentan dos métodos alternativos para el montaje de espesor vibratome: <ol><li><ol type="a"><li> Un espaciador puede ser creado mediante la colocación de un borde de grasa de vacío en un cuadrado alrededor de la sección de tejido. Por lo tanto, al establecer el cubreobjetos, los bordes del cubreobjetos se sellan con grasa de vacío. Presione sobre los bordes del cubreobjetos con el pulgar para que se adhiera firmemente a la diapositiva. Si la grasa de vacío es de forma clara y uniforme presente en todos los bordes del cubreobjetos, la caída será sellado suficiente para su uso en un microscopio confocal invertido. </li><li> Por otra parte, un separador se pueden crear utilizando la resina de agarosa cromatografía de malla conocidos (como Affi-Gel Gel Azul, Bio-Rad). Pipeta de 1 l de resina sobre el portaobjetos en cada una de las cuatro esquinas donde se coloca el cubreobjetos. Pipeta de un tejido de la sección de montaje y los medios de comunicación en el centro de los cuatro puntos de la resina. Cubreobjetos. Si se utiliza un microscopio confocal invertido, sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos de microscopio con nailpolish. </li></ol></li><li> Obtener secciones ópticas de las rebanadas de vibratome teñidas utilizando microscopía confocal. Para cuantificar los distintos tipos de células en el órgano de Corti, obtener un z-stack en un tamaño de paso definido (entre 1,5 y 3 micras). Secciones deben ser contra-teñidas con un colorante nuclear (paso 3.8). Las imágenes pueden examinarse en cualquier pantalla de la computadora después de la toma de imagen confocal. Las células pueden ser contados manualmente se observa la aparición y desaparición de núcleos como las imágenes se examinan de forma secuencial a través de la z-stack. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un representante confocal z-stack a través de una sección vibratome, teñidas con proteína S-100, que está presente en los pilares y las células de Deiters, y contrastados con un colorante nuclear (Fig. 3A-F). Cada panel es la imagen confocal a los 3 m-pasos, con el panel A de la imagen confocal obtener más cercana a la superficie de la sección vibratome y el panel de la imagen confocal F obtenido la mayoría de los internos dentro de la sección vibratome. La morfología del órgano de Corti parece mínimamente alterada. En particular, las extensiones de citoplasma de las células de los pilares no están rotos. Observando la aparición y desaparición de núcleos de células a través de la columna z-stack (Fig. 3A a 3F), tanto en número de células pilar interior y exterior se pueden contar (ver numeración, Fig. 3A -. F). Debido al reducido número de cada tipo celular por imagen confocal, este método puede ser usado para contar la mayoría de los tipos de células en el órgano de Corti. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Intacto, 15 semanas de edad, adultos oído interno encerrado en la cápsula ótica. (A) La cápsula ótica derecha (entre paréntesis) incrustado en el cráneo, visto desde un punto de vista del interior de la cabeza, después de la extracción del cerebro. Anterior está a la derecha. (B) se mantienen intactas, de 15 semanas de edad, el oído interno después de la disección del cráneo. Superficie lateral del oído interno izquierdo es visible, la superficie medial del oído interno derecho es visible. Las etiquetas indican la ubicación de la parte anterior del canal semicircular (ASC), co (cóclea), y OW (ventana oval). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) oreja completos al interior de un adulto de 15 semanas de edad, incrustado en agarosa en el centro de un molde desprendible. Avión destinado de la sección se indica. (B) primer plano la imagen de un niño de 15 semanas de edad, el oído interno entero antes de la inclusión. Una parte del hueso que lo rodea ha sido diseccionada por lo que el laberinto membranoso podría considerarse una forma más clara. El lateral del canal semicircular (LSC), anterior semicircular canal (ASC), y la cóclea (co) se trazan (curvas de color blanco). La vuelta basal de la cóclea (cabeza de flecha) y el plano intención de la sección (línea discontinua) se indican. (C) Representante de cross de la sección a través de la cóclea. En una sección transversal a través del conducto coclear, el órgano de Corti (º C) es en caja, la estría vascular (sv) se encuentra entre corchetes, y la membrana de Reissner (Rm) se indica. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. El órgano de Corti en un ratón de tipo salvaje en P21. (AF) serie secuencial confocal, en las células 3 micras de tamaño paso, a través de un S100 anticuerpo teñido de órgano de Corti para visualizar las células pilar y Deiters. Cuenta de células pilar interior y el exterior desde el principio hasta el final de la serie están contados. Abreviaturas: IHC (células ciliadas internas), aIHC (células ciliadas internas adyacentes), OHC (células ciliadas externas), PC (células pilar), DC (células de Deiters).

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	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Colegio Médico de Wisconsin IACUC.

El procedimiento de corte vibratome, seguido de imágenes de inmunohistoquímica y confocal permite la visualización del órgano de Corti con el mínimo daño a los tejidos. Claramente, las imágenes tomadas de la región confocal interna en la sección vibratome muestran una excelente conservación de la morfología celular que sólo está limitado por artificios de fijación. Confocal de imágenes tomadas cerca de las dos superficies de corte de una sección vibratome son a menudo indistinguibles de las imágenes de ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Leica VT1000S vibrante hoja microtomo </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 microscopio láser confocal de barrido </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estudiantes Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure bajo punto de fusión de agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Pele-A-Way incorporación de molde </td><td> Polysciences </td><td> 18986 o 18646A </td><td></td></tr><tr><td> albúmina de suero bovino </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> De suero de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 cabra anti-conejo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> Dilución 1:1000 </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector de Laboratorios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> grasa de vacío </td><td> Pescador </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Gel Azul </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

El órgano de Corti de mamíferos es un mosaico muy ordenado celular de pelo mechanosensory y apoyo a las células sensoriales (Revisado en 1,2). La visualización de este mosaico celular a menudo requiere que el órgano de Corti es seccionado. En particular, el pilar sensoriales y las células de Deiters, cuyos núcleos se encuentran basalmente con respecto a las células del cabello, no pueden ser visualizados sin cruz-seccionar el órgano de Corti. Sin embargo, la delicada citoarquitectura del órgano de Corti de mamíferos, incluyendo los procesos citoplásmicos bien de la columna y las células de Deiters, es difícil de mantener por los procedimientos de rutina histológica como la parafina y la crio-corte, que son compatibles con las técnicas estándar de tinción inmunohistoquímica. Aquí describo un procedimiento simple y robusto, que consiste en seccionar vibratome de la cóclea, la tinción inmunohistoquímica de estas secciones vibratome en el monte entero, seguido por microscopía confocal. Este procedimiento se ha utilizado ampliamente para el análisis immunhistochemical de múltiples órganos, incluyendo la yema del miembro del ratón, pez cebra intestino, el hígado, el páncreas y el corazón (ver 3.6 para algunos ejemplos). Además, este procedimiento fue exitoso para ambas imágenes y quantitificaton del pilar número de células mutantes en los órganos de control y de Corti, tanto en embriones de ratones adultos y 7. Este método, sin embargo, actualmente no se utiliza ampliamente para examinar el órgano de Corti mamíferos. El potencial de este procedimiento tanto para proporcionar una mayor preservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti para adultos y permiten la cuantificación de los diversos tipos de células se describe.

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Un procedimiento simple de vibratome seccionar el órgano de Corti, seguido por microscopía confocal de inmunohistoquímica y se describe. Este procedimiento permite una mejor conservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti de mamíferos, y por lo tanto permite la cuantificación exacta de los tipos de células.

Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K vistas.  Medical College of Wisconsin. Un procedimiento simple de vibratome seccionar el órgano de Corti, seguido por microscopía confocal de inmunohistoquímica y se describe. Este procedimiento permite una mejor conservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti de mamíferos, y por lo tanto permite la cuantificación exacta de los tipos de células.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

El método flotante para tejido parafina-encajado de seccionamiento y corte

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...