Este trabajo fue financiado por el NIH subvención EY005102 de SMC y EY018640 a la RCP

1. Intactos los preparativos retina neural de peces de colores, ratones y conejos <ol><li> Realizar todos los pasos siguientes, incluyendo los descritos en &quot;2) Corte de carga&quot;, en constante ambiental (de fondo) la iluminación. Tenga en cuenta que a los efectos de este protocolo, los procedimientos se describen como se realiza en la oscuridad constante (es decir, en condiciones muy oscuras (es decir, &quot;escotópica&quot;) las condiciones ≤ 0,0001 lux) con gafas de visión nocturna por infrarrojos, pero otros niveles más altos de intensidad de la iluminación ambiente constante puede utilizarse en lugar de determinar el efecto de otros niveles de iluminación ambiental en el cruce de acoplamiento brecha marcador. </li><li> Dark-adaptación de los animales de experimentación (peces de colores, ratón o conejo) por lo menos 1 hora antes de la cirugía. </li><li> Como se ha descrito anteriormente, 7, profundamente anestesiar peces de colores, colocándolas en tricaína metanosulfonato (MS222, 150 mg / L de agua tamponada (bicarbonato de sodio que contienen) pecera), y profundamente anestesiar a ratones con ketamina (100 mg/ Kg, ip) y Rompun (10 mg / kg, ip). Profundamente anestesiar a los conejos con uretano (dosis de carga: 2,0 g / kg, ip) y también el uso de anestesia local intraorbitario (2% de xilocaína), como se describió previamente 8. Todos los procedimientos experimentales relacionados con el cuidado y uso de animales debe realizarse de acuerdo con las normas federales y ser revisados ​​y aprobados por el cuidado de animales locales y los comités de la universidad el uso. (Nota:. En los experimentos descritos aquí, todos los procedimientos experimentales relacionados con el cuidado y el uso de peces, ratones y conejos fueron realizados de acuerdo con las directrices de NIH y fueron revisados ​​y aprobados por la Ohio State Cuidado de Animales Institucional de la Universidad y el empleo) </li><li> Para los peces, ratones y conejos, después de la enucleación, retire la parte anterior de cada globo ocular. A continuación, coloque un pedazo de papel de filtro en la parte superior de la parte posterior del ojo y se invierte el papel de filtro y el ojo, por lo que el papel de filtro por debajo de la parte posterior del ojo. Luego, utilizando bienpinzas de disección de la retina neural intacto desde la parte posterior del ojo suavemente pelando el epitelio pigmentario / coroides / esclerótica, que se unen el uno al otro, de la retina neural, que se adjunta al papel de filtro. Una vez hecho esto, cortar el nervio óptico con multa de resorte tijeras. La retina neural, orientado a los fotorreceptores del lado de arriba debe ser conectado al papel de filtro y separada del resto del ojo. </li></ol> 2. De corte de carga <ol><li> Sumerja las retinas de solución oxigenada de Ringer (Tabla 1) en una placa de 6 pocillos (~ 5 ml / pocillo) durante 30 minutos bajo constante ambiental (de fondo) iluminación (por ejemplo, en condiciones muy oscuras (es decir, &quot;escotópica&quot;) las condiciones) con o sin una prueba de drogas. Mantener las retinas de los peces en el oxigenada (5% de CO 2 / 95% O 2) de bicarbonato de Ringer a 22 ° C mediante el sellado de placa de 6 pocillos con parafilm y mantener las retinas de ratón y conejo a 36 ° C en un 5% de CO 2 / 95% O <sub&gt; 2 incubadora. Cuando una prueba de la droga que se utilice, debe estar presente durante todas las etapas posteriores hasta la fijación </li><li> Prepare la solución de trazador (típicamente 100 l) por disolución de neurobiotin (0,5%), una molécula de biotina, en solución de Ringer inmediatamente antes de cortar a través de la retina. Tenga en cuenta que el 0,5% rodamina dextrano (alta (&gt; 10.000) MW) se puede añadir a la solución. Debido a su alto peso molecular, rodamina dextrano no cruza uniones y las células sólo etiquetas que han sido dañadas por el corte. Como se muestra en la fig. 3, esta es una manera útil para distinguir las células que se han acumulado neurobiotin porque han sido heridos, de los que han acumulado el marcador por difusión a través de uniones. </li><li> Ponga la solución neurobiotin en una copa (o plástico) una placa de Petri, toque el papel de filtro, al que se une a la retina, sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de Ringer, baño una hoja de afeitar (o cuchilla afilada de otro tipo) en la solución y neurobiotin lan hacer un corte radial a través de la retina y el papel de filtro. Si se prefiere, se puede utilizar separadores para que el corte se hace a través de la retina, pero no el papel de filtro. El corte debe ser orientado perpendicular a la superficie de la retina. Sumerja la hoja de afeitar en la solución neurobiotin de nuevo y cortar la retina una segunda vez. Repita este hasta 4 cortes por la retina (ver fig. 1). Utilizar un microscopio de disección la hora de hacer cortes de navaja a través del ratón y otros pequeños retinas. </li><li> Como se muestra en la fig. 1, se sumergen en la retina de nuevo en medio del timbre fresco, con o sin prueba de la droga, con un 6-así placa (5 ml Ringer / pocillo). Incubar la retina durante 15 minutos para permitir la carga y la difusión. </li><li> Lavar tres veces durante 5 minutos cada uno con medio Ringer fresco con o sin prueba de la droga. </li><li> Fijar la retina con un 4% de paraformaldehído en 0,1 M de fosfato buffer (PBS, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar con PBS 0,1 M durante la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, reaccionan wITH 2% de estreptavidina-Alexa 488 (concentración final de 10 mg / mL) en 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, y mantener durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar tres veces durante 10 minutos cada uno con 0,1 M de PBS a temperatura ambiente </li><li> En PBS, desprenderse la retina del papel de filtro y luego, utilizando un pincel fino, el lugar de la retina, los fotorreceptores orientada hacia arriba, en un portaobjetos. </li><li> Suavemente montaje con Vectashield medio de montaje (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Tomar fotos con un microscopio confocal de barrido láser (por ejemplo, Zeiss 510 META) con el mismo aumento de resolución y ajustes para cada condición experimental, para que pueda comparar los efectos de diferentes condiciones experimentales (por ejemplo, medicamentos de prueba, las condiciones de iluminación) en la medida de brecha de la unión del trazador de acoplamiento (Fig. 2A-C y la fig. 4A-C). Aunque una sola imagen puede contener todas las células marcadas, se recomienda que recoja un z-stack de la zona de interés y el colapso en una solaimagen. </li></ol> 3. La cuantificación del marcador de acoplamiento con ImageJ <ol><li> En el explorador de imágenes LSM, abrir la imagen, haga clic en Exportar y guarde la imagen como un poco TIF-16 NO de archivos comprimidos. Barra de escala deben ser incluidos en esta imagen TIF. </li><li> Utilizando el software NIH ImageJ, medir la intensidad de fluorescencia de Alexa-488-etiquetados neurobiotin de imágenes de baja magnificación de todo el montaje retinas. Abra el archivo TIF con el software ImageJ y luego dibujar una línea recta que corresponde a la barra de escala. Ir al ANALIZAR, Definición de la escala y entrar en la distancia conocida y unidad de longitud, a continuación, haga clic en Aceptar. Ahora los resultados de medición se pueden presentar en las unidades de calibrado, como milímetros. </li><li> Seleccione el área de interés utilizando la herramienta de selección rectangular. El pico de la fluorescencia se debe colocar en el borde izquierdo de la selección. Asegúrese de que no hay ninguna señal de fluorescencia cerca del borde derecho. Si no es así, girar la imagen activa (imagen, a continuación, gire). </li><li> ClicAnalizar y gráfico de perfil. Usted debe ver una curva con un decaimiento exponencial de la izquierda a la derecha. </li><li> Haga clic en Copiar en la ventana pop-up y pegar en Excel. Ahora se ven dos columnas que muestra la distancia de la corte (columna izquierda) y la intensidad de fluorescencia en función de la distancia de la corte (columna derecha). </li><li> Divida cada valor de fluorescencia prima por el valor máximo de fluorescencia para obtener la intensidad de fluorescencia relativa. </li><li> Copiar dos columnas correspondientes a la distancia de la corte (X) y la intensidad de fluorescencia relativa (Y), y luego pegarlos en el software de origen. </li><li> Encajar con el decaimiento exponencial # 1 función (Fig. 2D y 4D fig.), Que es en la forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) donde Y es la intensidad de fluorescencia relativa, Y o es la fluorescencia de fondo, Y max es la fluorescencia relativa máxima, λ es la spas (longitud) constante, y x es la distancia desde el corte. </li><li> Compare el espacio constante (λ) los valores en diferentes condiciones experimentales utilizando el t-test o ANOVA (Fig. 2E y 4E fig.). Tenga en cuenta que las técnicas alternativas de cuantificación han sido descritas por otros 13,14. </li></ol> 4. Resultados representante Ejemplos representativos de trazador células fotorreceptoras de acoplamiento según lo determinado por el corte de carga se presentan en las figuras 2 y 3 (pescado) y la Figura 4 (conejo). Confocal imágenes fueron tomadas usando los mismos parámetros de comparación (Fig. 2A-C y la fig. 4A-C) y la intensidad de fluorescencia se representa en función de la distancia desde el corte y el montaje de la función exponencial se muestra en el número 3.8 (Fig. 2D y 4D fig.). Espacio de valores constantes para cada condiciónse muestran en las figuras 2E y 4E, lo que demuestra que el grado de unión de acoplamiento brecha trazador puede ser cuantificado mediante la técnica de corte de carga. Además, los resultados son altamente reproducibles. El uso de la técnica de corte de carga como un medio para cuantificar el grado de unión de acoplamiento brecha trazador también se confirma por el hallazgo de que la intensidad de fluorescencia disminuye de forma exponencial en función de la distancia de la corte en todos los casos examinados 7,8 (véase también Figs. 2D y 4D aquí), lo que indica que neurobiotin entró a través de los fotorreceptores de la corte de afeitar y no de otros lugares de la retina. Por otra parte, la cualitativamente similares de día / noche la diferencia en el acoplamiento de los fotorreceptores trazador celular observado en peces de colores con las inyecciones de trazador en los conos individuales y con un corte de carga de 7 corrobora de corte de carga como un medio relativamente precisa de medir el grado de acoplamiento de los fotorreceptores. El corte de loading técnica también se puede utilizar para investigar otros tipos de sinapsis eléctricas en la retina. Por ejemplo, la Figura 5 muestra el conejo de tipo A (Fig. 5) y tipo B (Fig. 5B) las células horizontales muestran homóloga marcador de acoplamiento después de cortar la carga y la difusión de neurobiotin adaptada a la oscuridad bajo condiciones. <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td> Pescado </td><td> Ratón </td><td> Conejo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Cuadro 1: Composición de las soluciones de Ringer para peces de colores, el ratón y las retinas de conejo. Las concentraciones se presentan en mM. Soluciones de Ringer se traspasan con CO2 al 5% / 95% O 2 y se mantiene a 22 ° C (de pescado) o 36 ° C (mamíferos). &quot;-&quot; No se incluye en el timbre para esta especie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Figura 1:. Diagrama de flujo que muestra el procedimiento de corte de carga. Tras el aislamiento of de la retina neural intacto, varios cortes radiales fueron hechas por una lámina que se sumerge por primera vez en solución neurobiotin 0,5%. La retina se incubó durante la carga y la difusión del trazador, y luego se lavan antes de la fijación con paraformaldehído al 4% (PFA) en 0,1 M de tampón fosfato (PB). Trazador de acoplamiento fue examinada utilizando estreptavidina conjugada con Alexa-488. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Figura 2. Día-noche diferencia en los fotorreceptores de acoplamiento del trazador en peces de colores se revela mediante la técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junction neurobiotin marcador de acoplamiento fue extensa en la noche (B) y en el día después de la aplicación de spiperona (10 M), un selectivo de la dopamina D 2 antagonista de los receptores (C), pero no en el día bajo condiciones control (A). D) normalizado intensidad relativa de fluorescencia en función de la distancia de los cortes (indicado por las flechas en AC). E) Espacio valores constantesUES obtenidos a partir de los datos en los experimentos D y otros (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Figura 3. Un ejemplo representativo que muestra la fluorescencia en la capa de células fotorreceptoras de la retina adaptada a la oscuridad peces de colores en la noche después de cortar la carga con una solución de dos neurobiotin y dextrano rodamina. Rodamina dextrano (en rojo), que no se difunde a través de canales abiertos de unión brecha debido a su alto peso molecular (&gt; 10.000 MW), sólo las células marcadas cerca del corte. Por el contrario, neurobiotin (en verde) difundido a través de uniones y se puede ver en las células fotorreceptoras lejos de la corte. La ubicación de la corte es indicado por la flecha en cada panel. Barra de escala: 200 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Figura 4. Día-noche diferentecia en los fotorreceptores marcador de acoplamiento en retina de un conejo se revela mediante la técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junction neurobiotin marcador de acoplamiento fue extensa en la noche (B) y en el día después de la aplicación de spiperona (10 M) (C), pero no en el día bajo condiciones control (A). En AC, puntos de vista perpendicular de la reconstrucción 3D de los fotorreceptores de conejo, cerca de la corte se muestran. D) normalizado intensidad relativa de fluorescencia en función de la distancia de los cortes. E) los valores del espacio constante de los datos obtenidos en los experimentos D y otros (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Figura 5. Corte de carga revela que adaptada a la oscuridad células de conejo horizontal se trazador unido. Tanto de tipo A (A) y tipo B (B) en las células horizontales adaptados a la oscuridad retinas de conejo mostraron homóloga neurobiotin acoplamiento marcador.

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Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. 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No hay conflictos de interés declarado.

El método de corte de carga se describe aquí es una técnica útil y sencilla para determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre las neuronas retinales en condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche. Las ventajas de esta técnica incluyen la posibilidad de cuantificar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre las neuronas en el tejido de la retina intacta bajo una variedad de condiciones de iluminación durante el día y la noche y que lo haga para que las neuronas que se han unido somata de pequeño diámetro. Limitaciones de la técnica en el estudio de uniones en el otoño de tejido intacto en dos categorías generales. En primer lugar, la difusión del trazador a través de uniones abiertas pueden ser relativamente difíciles de observar debido a: a) el pequeño diámetro de la carga o asociados a los canales abiertos y b) 1,14,15 los volúmenes relativos de acoplamiento compartimentos celulares. Es decir, la difusión de los rastreadores de una pequeña celda a una celda más grande o un grupo de células acopladas, un borradorared a la difusión de los rastreadores de una celda más grande que una celda más pequeña, puede ser más difícil de detectar debido a la dilución del trazador. En segundo lugar, bajo ciertas condiciones fisiológicas, el grado de difusión del trazador a través de uniones en el tejido intacto, no puede reflejar con precisión la fuerza de la conductancia brecha ocasiones debido a las diferencias en la conductancia de la pequeña corriente eléctrica de transporte de iones, en comparación con la permeabilidad del marcador relativamente grande moléculas 1,14,15. En general, la evidencia del marcador de acoplamiento sugiere fuertemente la presencia de funcionamiento, los canales abiertos brecha de unión, pero bajo ciertas condiciones fisiológicas, la difusión del trazador puede no ocurrir o ser observado a pesar de que los registros electrofisiológicos sugieren la presencia de funcionamiento, uniones abiertas. Parece probable que la técnica de corte de carga también se puede utilizar para investigar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre las neuronas en el tejido intacto de otras regiones del sistema nervioso centralTEM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Tricaína metano sulfonato (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L de agua tamponada pecera </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / dosis kgloading </td></tr><tr><td> Noche de doble tubo de visión Goggle </td><td> Noche Óptica EE.UU. </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> El filtro de papel, N º 4 º grado </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas finas, Dumont N º 5, Biologie, 11 cm de largo </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Tijeras finas, con resorte, 8 mm hoja, recto </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vector </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Estreptavidina conjugada con Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextrano rodamina (alta (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield medio de montaje </td><td> Vector </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META microscopio confocal de barrido láser </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab Corp. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

Además de la transmisión sináptica química, las neuronas que están conectadas por uniones también se pueden comunicar rápidamente a través de la transmisión sináptica eléctrica. Aumento de la evidencia indica que los cruces brecha no sólo permiten el flujo de corriente eléctrica y la actividad sincronizada entre las células interconectados o acoplados, pero que la fuerza o la eficacia de la comunicación eléctrica entre las células puede ser modulada, junto a un 1,2 en gran medida. Además, el gran diámetro interno (~ 1.2 nm) de muchos canales brecha unión permite no sólo el flujo de corriente eléctrica, sino también la difusión de moléculas de señalización intracelular y pequeños metabolitos entre las células interconectadas, de modo que uniones también pueden mediar en la comunicación metabólica y química . La fuerza de la falta de comunicación entre las neuronas de la unión y su modulación por neurotransmisores y otros factores pueden ser estudiados de manera simultánea la grabación eléctrica a partir de células acopladas y por la determinación de tl grado de difusión de moléculas de trazador, que se diferencia de unión permeable, pero no una membrana permeable, después de la inyección iontoforético en células individuales. Sin embargo, estos procedimientos pueden ser extremadamente difíciles de realizar en las neuronas con cuerpos celulares pequeños en el tejido nervioso intacto. Numerosos estudios sobre las sinapsis eléctricas y la modulación de la comunicación eléctrica se han realizado en la retina de los vertebrados, ya que cada uno de los cinco tipos de neuronas de retina está conectada eléctricamente por uniones 3,4 brecha. Cada vez más evidencia ha demostrado que el circadiano (24 horas) en punto de la retina y cambios en la estimulación de la luz regulan brecha de la salida de acoplamiento 3-8. Por ejemplo, trabajos recientes han demostrado que el reloj circadiano retina disminuye acoplamiento brecha de unión entre la varilla y las células fotorreceptoras de cono durante el día mediante el aumento de la activación de los receptores de dopamina D2, y aumenta dramáticamente de conos y bastones de acoplamiento en la noche por la reducción de la activación del receptor D2 <sup&gt; 7,8. Sin embargo, no sólo se trata de estudios muy difíciles de realizar en las neuronas con cuerpos celulares pequeños en tejido de la retina neural intacto, pero puede ser difícil de controlar adecuadamente las condiciones de iluminación durante el estudio electrofisiológico de neuronas de la retina solo para evitar la luz inducida por los cambios en la brecha de la salida conductancia. A continuación, presentamos un método sencillo de determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre las neuronas retinales en condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche. Esta técnica de corte de carga es una modificación de la carga de raspar 09/12, que se basa en la carga de tintes y difusión a través de canales abiertos de unión brecha. Raspe la carga funciona bien en células cultivadas, pero no en rodajas gruesas, como la retina intacta. La técnica de corte de carga se ha utilizado para estudiar el acoplamiento de los fotorreceptores en los peces y mamíferos intactos retinas 7, 8,13, y puede ser utilizado para estudiar el acoplamiento entreotras neuronas de la retina, como se describe aquí.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Un método sencillo y práctico para determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre neuronas de la retina se describe. Esta técnica le permite a uno para investigar la función de las sinapsis eléctricas entre las neuronas de la retina intacta bajo condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche.

De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

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JoVE Journal

Neuroscience

15.3K vistas.  Ohio State University College of Medicine. Un método sencillo y práctico para determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre neuronas de la retina se describe. Esta técnica le permite a uno para investigar la función de las sinapsis eléctricas entre las neuronas de la retina intacta bajo condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche.

Video: Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

La transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

Un Protocolo de PET-MRI Dual trazador para la medición cuantitativa de la Regional del cerebro Energía Sustratos captación en la rata

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Una tubería estandarizada para examinar la morfometría de materia gris cerebelosa humana utilizando imágenes de resonancia magnética estructural

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...