우리는 기술 지원에 대한 지속적인 지원과 에바 Blaas에 대한 해밀턴 프로그래머와 전문가를 주셔서 감사합니다. T5 - 207 : SJ는 티 - 제약에 의해 지원되며이 작품은 두 NWO 투자 보조금 (911-07-031 및 40-00506-98-10011), Prinses이 Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 신경 과학 캠퍼스 암스테르담에 의해 지원되었다.

1. 자동 자기편 세포 배양 과정 (그림 1) 20 <ol><li> 세포 배양 접시의 입력을위한 자동 세포 배양 시스템을 준비합니다. 로드 소모품 (예 : 피펫 팁, 세포 배양 접시, 검정 접시) 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 사용하여 시스템에. 충분한 세포 배양 매체가 있는지 확인, 인산은 로봇 시스템에 식염수 (PBS)와 트립신을 버퍼. </li><li> SH - SY5Y neuroblastoma 세포주의 접시 당 2 × 10 6 세포와 수동으로 씨앗이 omnitray 번호판입니다. 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Opti - 가상의 세포를 유지합니다. GUI를 사용하여 세포 배양 로봇에 접시를 넣어. 세포는 37 ° C와 5% CO 2에서 incubated 것입니다. </li><li> 문화 프로토콜 20을 시작되어야하는 세포를 선택하십시오. 하나는 자기편 세포 배양 과정 22, culturing 마우스 피더 세포 23 또는 정지 cel의 culturing에 배아 줄기 (ES) 세포의 확장에서 선택할 수 있습니다혹시 22. </li><li> 자기편 세포 배양 프로토콜 (그림 1)을 선택하고 자기편 세포주 특정 매개 변수 파일이 합류 임계값 (세포를 포함하는 omnitray 판의 지역) 70 %로 설정되도록 조정됩니다 보장합니다. 이분에 총 trypsinization 시간을 설정합니다. </li><li> 접시 당 2 × 10 6 세포의 시딩 셀 번호와, 새로운 omnitray 번호판을 준비하는 로봇을 지시한다. </li><li> 자동 자기편 세포 배양 프로토콜 (그림 1)를 사용하여 세포 배양 시스템에 입력 omnitray 플레이트. 이 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함 : 접시는 incubated들이 미리 정의된 합류 임계값에 도달할 때까지 몇 군데 있습니다. 세포는 5 판독 값 이내에 합류 임계값에 도달하지 않는 경우, 접시는 시스템에서 제거됩니다. 사용자 정의 합류 임계값에 도달되면, 세포는 씻어 trypsinized 및 계산됩니다. 세포의 미리 정의된 번호는 새로운 omnitray 접시에 추가하고있어 세포의 충분한 숫자, 지정된 마비가있는 경우검정 접시의 응급실은 데크로 이송하고 세포의 정의된 숫자가 각 우물에 적절하고 있습니다. 검정 접시 직접 추가 처리를 위해 시스템에서 통합 현미경 또는 출력을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. </li><li> 물론 5,000 세포의 총과 함께 omnitray 플레이트 당 사 분석 접시를 준비 시스템을 지시한다. </li></ol> 2. 검정 접시에 shRNA 바이러스 제작 및 도금 (소요 시간 : 6 일) <ol><li> ampicilin 100 μg / ML (시그마 - 올드 리치)이있는 Luria - Bertani 매체 미디어의 2ml에서 하룻밤 shRNA 벡터 (열기 Biosystems, TRC1)이있는 세균의 글리세롤의 주식을 성장. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (Promega 마법사 MagneSil Tfx) 다음과 같은 plasmids의 압축을 풉니다. </li><li> RNAi 컨소시엄 하이 처리량 Lentiviral 제작 (96 자 판) 프로토콜 24을 사용하여 바이러스를 생산하고 있습니다. 전달에 사용되는 바이러스 입자 복제 - 결함이며, 분할 때문에 lentivirus 작업하는 것은 상대적으로 안전합니다유전자 패키징 전략은 자신의 생산에 사용됩니다. 그러나, lentivirus 작업을 할 때, 추가 biosafety 절차는 자신과 다른 25 위험을 최소화하기 위해 필요합니다. 모든 실험은 MLII 또는 BSL2 안전 수준의 연구실에서 수행되어야합니다. lentivirus 입자와 접촉하고 모든 플라스틱은 (pipettes, 플라스틱 접시, 미디어) 처리하기 전에 24 시간 동안 표백제와 incubated해야합니다. </li><li> 플라스미드 pLKO.1 GFP를 (시그마 - 올드 리치)를 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정하여 lentivirus의 감염의 다중성을 (방어)을 계산. </li><li> 입니다만 3와 분석 접시에 접시 lentivirus. </li></ol> 3. Lentiviral 전달 및 SH - SY5Y 세포 (소요 시간 : 6 일)의 분화의 연결 <ol><li> 세포 (1.7 단계 참조) 분석 플레이트에 추가됩니다. 자동 세포 배양 시스템에의 shRNA lentivirus을 포함하는 분석 번호판을로드합니다. </li><li> 24 시간 후에, 미디어검정 접시는 0.5 % FBS 및 차별화 과정을 시작하려면 0.1 μm의 retinoic 산성을 포함 Opti - 가상으로 변경됩니다. SH - SY5Y 세포의 분화는 neuritic 구조의 시각화 수 있도록하고 세포 분열을 동기화합니다. </li><li> 오일에 대한 차별화 미디어의 분석 접시의 배양을 계속합니다. 이것은 목표 유전자 표현의 최대한의 최저을 보장합니다. </li><li> 5 일째, mitochondria에 DJ1의 translocation을 촉진하기 위해 24 시간 동안 분석 접시의 절반 50 μm의 H 2 O 2를 추가합니다. </li><li> 일 6 일에 잘 200 NM의 최종 농도에서 세포 Mitotracker의 CmxROS (Invitrogen)를 추가하고 37 품어 ° C를 30 분. </li><li> 하나는 직접 HC 영상기 또는 접시가 추가 처리를 위해 시스템에서 내보낼 수를 사용하여 이미지 판에 시스템을 지시하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 검정 접시의 자동 immunostaining (소요 시간 : 2 일) 이미지 품질 paramoun입니다민감하고 신뢰할 수있는 HCS를 실시하기 위해 T. 정확 pipetting에 의한 세포 monolayer에 손상이 좋지 이미지 품질과 irreproducible 결과를 초래할 수 있습니다. 셀 계층 피해를 최소화하기 위해 immunostaining는 로봇 스테이션을 사용하여 실시되었다. 절차는 이전 26 설명했습니다 하나 비슷하지만 처리량을 증가시키고 소모품 사용량을 줄이기 위해 정의되었습니다. <ol><li> 100 4 % paraformaldehyde의 μl 37 미리 예열 ° C. 세포와 수정 상온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS는 10 분 0.1 %의 트리톤 (PBST)이있는 200 μl와 분석 번호판을 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> 상온에서 1 시간 블록 버퍼 200 μl (5 % FBS와 PBST)로 분석 번호판을 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> foll과 부화4 하룻밤 때문에 일차 항체 ° C : <ol><li> 염소 DJ1 N20 (산타 크루즈, 5 μg / ML) </li><li> 토끼 β - III의 tubulin (시그마 - 올드 리치, 1 μg / ML) </li></ol></li><li> 다음날 5 분, 3 번 PBS 200 μl와 세포를 씻는다. </li><li> 상온에서 다음 이차 항체 일시간와 분석 번호판을 품어 : <ol><li> AlexaFluor 488 당나귀 안티 - 염소 (Invitrogen, 2 μg / ML) </li><li> AlexaFluor 647 염소 안티 - 토끼 (Invitrogen, 2 μg / ML </li></ol></li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> 10 분, Hoechst (1 μg / ML Invitrogen)로 품어 세포. </li><li> 5 분 3 회 200 μl PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 4 스토어 번호판 ° C까지 그들은 몇 군데 있습니다. </li></ol> 5. (소요 시간 : 5 일) 높은 콘텐츠 이미지 수집 및 이미지 분석 <ol><li> 20x 목적 렌즈를 사용하여 잘 초당 30 필드의 총 이미지. FI와 DJ1를 떠올TC 필터 설정 TRITC 필터 설정 Cy5 필터 세트와 UV 필터 세트 (그림 3)를 사용하여 핵과 β - III의 tubulin과 mitochondria. </li><li> mitochondria 내에서 Mitotracker 신호의 평균 강도를 결정하기 위해 Compartmental 분석 Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. (그림 4B, F). </li><li> DJ1과 mitochondria 사이의 평균 오버랩 계수를 확인하려면 Cellomics Colocalisation의 bioapplication (Cellomics, ThermoFisher)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 다음과 같이 관심 영역 (ROI)을 정의 : 투자 수익 (ROI) - 핵 (그림 4A, E), 투자 수익 (ROI) B - mitochondria (그림 4 B, F). 은 세포질의 분석을 보장하기 위해 투자 수익 (ROI) B의 투자 수익 (ROI)을 제외할 수 있습니다. 대상 지역 대상 지역 II (그림 4C, G)로 I와 DJ1으로 mitochondria를 정의합니다. </li><li> β - III의 tubulin의 얼룩 (그림에서 neurites의 평균 길이를 추적의 연결 프로 파일링 bioapplication (Cellomics, Thermofisher)를 사용하여 이미지를 분석4D, H). </li><li> 오페라 LX 자동 공촛점 리더 (Perkin - 엘머)를 사용하여 이미지 번호판입니다. 물 물속 60x 객관적인 렌즈를 사용하여 잘 초당 30 필드의 총 이미지. UV 여기로 561 NM 레이저와 핵과 mitochondria 시각화. </li><li> 그 자리 에지 - 리지 (SER) 텍스쳐 기능 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. SER - 릿지 필터 산등성이 같은 패턴을 형성 픽셀 강도를 전송합니다. 더 많은 조각 mitochondria, 높은 SER - 릿지 점수 (그림 8). </li></ol> 6. 데이터 정규화 및 분석 <ol><li> R 소프트웨어 환경에 대한 BioConductor CellHTS2 패키지 (R 버전 2.11.1, BioConductor 버전 2.6)에 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 가져옵니다. </li><li> 대수베이스 (2) 사전에 당 평균 판을 기반으로 정상화 27, 28 데이터를 변환. 판 당 편차 조정을 적용하지 마십시오. </li><li> 표현형의 수정자를 확인하려면 differe 사이에 양방향 ANOVA를 사용하여NT 치료 그룹 즉 감염 치료 세포를 으깬 대 독소 치료 세포 대 타겟 유전자 치료 세포 대 타겟 유전자 치료 세포를 (그림 5-7) 발진. </li></ol> 7. 대표 결과 DJ1 내에서 변이는 초기 발병 - 열성 parkinsonism 21 야기할하지만 DJ1의 손실은 질병 표현형에 상승을 제공하는 방법 확실하지 않다. 그것은 DJ1의 결함 세포가 더 산화 스트레스 유발 세포 죽음에 감염될과 산화 스트레스, mitochondria 29 세포질에서 DJ1 translocates, 30에 대응되는 것으로 알려져 있습니다. 이 phenotypes을 모니터 HC의 assays를 구축함으로써, 우리는 DJ1와 관련된 phenotypes을 조절하거나 영향을 미치는 유전자를 확인할 수 있습니다. 이 방법은 해독 기능 DJ1하고이 질병 pathogenesis에 관여 수있는 내의 경로 도움이 될 수 있습니다. DJ1과 epistatic 상호 작용 (그림 5)의 예 : 노출 셀에 DJ1의 최저세포 생존에 큰 손실 독소 결과 (BAR - B : 이미지 - B) 스크램블 lentivirus에 감염된 세포에 비해 (BAR - A : 이미지). 대상 유전자의 최저 A는 DJ1 최저 (이미지 - C 바 - C)과 세포에서 관찰 것과 비슷한 효과가 있습니다. DJ1 및 대상 유전자 혼자 두 유전자의 손실 (이미지 - D BAR - D)보다 세포 생존 능력이 상당히 큰 손실 결과를 모두 최저. 이것은 DJ1과 대상 사이의 유전자 A. epistatic 상호 작용을 제시 세포가 독소에 노출되고, mitochondria으로 세포질에서 DJ1 translocates, DJ1 간의 높은 중복 계수와 mitochondria (BAR - A에 의해 계량입니다 : : 이미지 비교 DJ1 translocation (그림 6)을 조절 유전자의 예 BAR - C : 이미지 C). 대상 유전자 B가 침묵되었습니다 세포에서 적은 mitochondria에 DJ1 translocates은 세포가 독소에 노출된 경우. 이것은 목표 유전자 B는 mitochondria에 DJ1의 전송에 관련되어 제안합니다. (BAR - B :<html> 이미지 B 및 BAR - D : 이미지 D) neurite 길이 크게 증가 야생 타입 SH - SY5Y 세포 결과에서 대상 유전자 C의 최저 :의 연결을 가지 (그림 7)에 참여 유전자의 예 (BAR - B는 : 이미지 - B) 스크램블을 표현 lentivirus에 감염된 세포에 비해 shRNA (BAR - A : 이미지). 이 효과는 독소 (BAR - C 및 D)과 함께 incubated 셀에 손실됩니다. mitochondrial 형태 (그림 8)에 참여 유전자의 예 : mitochondrial SER - 릿지 세분화 값 (그림 8, 이미지 C 및 D)의 감소에 유전자 D 결과를 타겟팅하는 shRNA와 야생 타입 SH - SY5Y 세포의 감염에 비해 세포 잡음이 lentivirus (그림 8, 이미지 A와 B)에 감염된. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> 그림 1 자동 세포 배양 프로토콜의 개요. : ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> 그림 2 도식 심사 과정에 대한 개요, 이미지 분석 및 심사 과정에서 사용되는 통계 방법 :. 그들이 합류하고 shRNA의 lentivirus를 포함하는 분석 접시에 연속적으로 도금 때까지 I) 세포가 양식입니다. 셀은 5 일 동안 차별하고 독소는 다음 24 시간 동안 접시에 추가됩니다. 검정 접시는 시스템에서 출력하고 immunostained. 프로세스의 각 촬영 시간 금액은 괄호 안에 표시됩니다. ii) 본 데이터는 HC 영상기 (세포 생존 능력, 단백질 translocation과의 연결을 가지) 및 자동 공촛점 이미지 전송 (mitochondrial 형태)를 사용하여 인수입니다. 데이터가 R 내에 CellHTS2 패키지 수출,베이스는 (2) 변환하고 정규화 로그인하십시오. 양방향 ANOVA는 다른 변수 사이의 중요한 상호 작용을 식별하는 데 사용됩니다. 그림 3. HC 이미징 인수 세포의 복합 이미지. A) 치료 세포, B) 세포는 H 2 O 2 치료. DJ1은 녹색, 빨간색과 파란색의 핵에 mitochondria에 표시됩니다. Neurite의 얼룩이 강조 표시되지 않습니다. <img alt="그림 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> 그림 4. HCS에서 얻은 몇 가지 세포 기능의 부량. AD) 치료 SH - SY5Y 세포. EH) H 2 O 2 처리 SH - SY5Y 세포. 투자 수익 (ROI)의 A, E) 핵의 세분화 및 정의, mitochondria, 투자 수익 (ROI) B의 B, F) 확인 및 부량, C, G) DJ1의 확인, 대상 채널 II, 평균 neurite 길이의 D, G) 식별 및 계산. 이미지의 가장자리에 가까운 세포는 분석에서 제외됩니다. 삽입 이미지 사전 분석에 이미지 수 있습니다. <img고도 = &quot;그림 5.&quot; SRC는 = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot;/&gt; 그림 5. DJ1 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당)와 epistasis에서 유전자의 식별. 이미지는 D를 통해 A는 세포 건강 부량 사용되었다 Mitotracker CMXRos (적색)으로 표시 SH - SY5Y 세포 수 있습니다. <img alt="그림 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> 그림 6. DJ1 translocation을 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당하는) 규제 유전자의 식별. 이미지는 D를 통해 A는 mitochondria에 DJ1 translocation의 부량 사용되었습니다 mitochondria DJ1 (녹색), (빨간색)과 핵 (파란색)에 대한 표시 SH - SY5Y 세포 수 있습니다. <img alt="그림 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> 그림 7. 파생물의 연결과 관련된 유전자의 식별 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당). D를 통해이 neurite 길이의 부량에 사용된 β - III의 tubulin (녹색)과 핵 (파란색)에 대한 표시 SH - SY5Y 세포있는 이미지. <img alt="그림 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> 그림 8. mitochondrial 형태와 규제에 관련된 유전자의 식별. 이미지 및 C는 각각 스크램블 shRNA 또는 shRNA 대상으로 유전자 D에 감염 SH - SY5Y 세포 합성 이미지입니다. 핵이 파란색으로 색깔있는 동안 Mitochondria는 빨간색으로 물들어 있습니다. 이미지 B와 D는 SER - 리지의 부량의 시각화 있습니다.

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	<li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461, 908-915 (2009).</li><li>Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+'omic'+information:+a+bridge+between+genomics+and+systems+biology.">Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology.</a> Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).</li><li>Zhu, H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Omic'+approaches+for+unraveling+signaling+networks.">'Omic' approaches for unraveling signaling networks.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68, 207-217 (2010).</li><li>Manolio, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Nalls, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson's+disease:+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies.">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377, 641-649 (2011).</li><li>Simon-Sanchez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+confirms+extant+PD+risk+loci+among+the+Dutch.">Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch.</a> Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).</li><li>Van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductionism+and+complexity+in+molecular+biology.+Scientists+now+have+the+tools+to+unravel+biological+and+overcome+the+limitations+of+reductionism.">Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism.</a> EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).</li><li>Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+needle+in+the+haystack:+why+high-throughput+screening+is+good+for+your+health.">Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health.</a> Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Introduction: cell-based assays for high-throughput screening.</a> Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).</li><li>Conrad, C., Gerlich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscopy+for+high-content+RNAi+screening.">Automated microscopy for high-content RNAi screening.</a> J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).</li><li>Thomas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening:+a+decade+of+evolution.">High-content screening: a decade of evolution.</a> J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+in+neuroscience.">High-content analysis in neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).</li><li>Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+neurodegeneration+and+complex+disease+phenotypes.">High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).</li><li>Durr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hit+identification+by+quality+assurance+and+multivariate+data+analysis+of+a+high-content,+cell-based+assay.">Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay.</a> J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationships+between+huntingtin+levels,+polyglutamine+length,+inclusion+body+formation,+and+neuronal+death+provide+novel+insight+into+huntington's+disease+molecular+pathogenesis.">Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis.</a> J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).</li><li>Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Automation+of+Cell+Culture.">The Complete Automation of Cell Culture.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).</li><li>Bonifati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DJ-1+gene+associated+with+autosomal+recessive+early-onset+parkinsonism.">Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism.</a> Science. 299, 256-259 (2003).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+Subculturing+Mammalian+Cells.">Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen.">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124, 1283-1298 (2006).</li><li>Volksgezondheid, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrale+versie+van+de+Regeling+genetisch+gemodificeerde+organismen+en+het+Besluit+genetische+gemodificeerde.">Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde.</a> Organismen. , (2004).</li><li>Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+and+Astrocyte+Co-Culture+Assay+for+High+Content+Analysis+of+Neurotoxicity.">A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity.</a> J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).</li><li>Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어

유전자 기능을 수정하는 강력한 게놈 - 광범위한 도구의 가용성과 함께 HT / HC 세포 검사 시스템의 비용 감소와, HT / HC 화면 학계에서 일상지고 있습니다. 접근 방식은 이미 성공적으로 이러한 암 9, 31-33 및 34-36 배아 개발의 약물 표적의 식별과 같은 연구의 다양한 분야에 적용되고 심지어 neuropsychiatric 장애 37,38에 관련된 경로를 파악의 응용 프로그램에 대한 잠재력을 갖고있다. 그러나 이러한 시스템의 구현은 시간과 종종 6 개월 최소 복용 공정 최적화를 통해 노력의 상당한 투자를 필요로합니다. 이러한 trypsinization 시간, pipetting 속도와 시딩 밀도 등 모든 단계는 세포가 건강한 것을 확인하고 지속적으로 성장하기 위해 조정해야합니다. 세균 오염의 방지는 C에서 매주 청소 프로토콜과 자동 세포 배양을 직면하고있는 가장 어려운 문제 중 하나입니다오염 무료로 문화가 필요하고 70 % 에탄올로 모든 액체 베어링 라인 rinsing 상수와 ombination. 그것은 로봇을 향상시키기 위해 또한 필요합니다 그래서 이러한 높은 해상도와 -80 화합물 스토리지 ° C 냉동고가 통합될 수에 대한 공촛점 현미경 같은 추가 악기. 유전자 네트워크를 연구하고 병원성 분자 경로에 관련된 유전자를 확인하기 위해이 방법의 민감한, 속도 및 유틸리티를 개선하기 위해 해결되어야 할 한계도 있습니다. HT / HC 화면을 실시하고 신뢰할 수있는 데이터가 수집되었는지 확인하기 위해 몇 가지 측면 최적화해야합니다. 첫째, 측정의 신뢰도는 파라마운트이며, 분석의 견고하고 감도에 의존적일 수 밖에 없습니다. 예를 들어, assays 위에서 설명한 작은 화면에 적합하지만, 인해 이미지 수집하기 전에 필요한 숫자 처리 단계에 게놈 넓은 규모에 구현하기가 어렵습니다.따라서, 하나는 직접 영상에 대한 허용 및 가공 단계의 수를 감소로 인해 감소 변화로 이어질 것입니다 리포터 유전자를 표현하는 안정적인 세포 라인을 구축해야합니다. 현재 정확하게 묘사하고 안정적​​으로 관심 표현형이 HC 심사 과정에서 주요 병목이다 quantifies 분석을 설계. 많은 화면은 오프 대상 효과, 제한된 유전자 입을 효율성 및 불완전한 게놈 범위에서 고통받는 모든 것 중에서 다른 RNAi 라이브러리를 사용하여 포유류 세포에서 실시하고 있습니다. 따라서 도서관은보다 구체적인, 강력한하고 더 나은 범위를 보유하고있는하여야합니다. 노력은 만들 진행 등 그것은 이러한 노력은 HT / HC scre의 재현성을 향상시킬 계획이다<html> 욕실 안타. 그들은 유전자 상대적으로 쉽게 조작 및 대형 숫자 교양 수 있기 때문에 많은 대형 셀 기반 화면의 제한은 그들이 neuroblastoma 세포에서 실시한다는 점입니다. 그러나, 생체내 기능에 전 (前) 생체내 세포 배양 모델에서 확인된 &#39;히트&#39;의 관련성이있는 두뇌는 고도로 통합된 단위로 기능 시냅스 연결의 밀도와 복잡한 네트워크를 형성 고도로 전문화된 세포 유형으로 구성되어 있습니다 특히, 의심됩니다. 그 결과로서, 그것은 위에서 설명한 심사 접근법을 사용 식별, 추가 기술을 사용하여 보조 화면에서보다 생리 관련 모델을 39 확인 아르 안타 것이 일반적입니다. HCS 동안 확인된 히트의 번역을 개선하기 위해 이러한 기본 세포와 차별화된 줄기 세포 또는 공동 문화 시스템과 같은 더 많은 대표와 정교한 모델 개발 및 HT / HC 방식에 맞게해야합니다. 자동 세포 culturing 및 HC 이미지 하나의 조합 ntent &quot;&gt; 빠르게 뉴런이 작동하는 방법에 새로운 통찰력을 얻고있는 경로는 질병 개발에 중요하다. 다른 &#39;omics&#39;접근 방식에서 생성된 정보와 HCS / HTS 데이터를 결합하여 확인할 수 있습니다, 그것은 것입니다 그리고 따라서 치료 개발을 촉진, 뇌 질환의 시스템 생물학의 개요를 구축하는 것이 가능합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> 해밀턴 </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI - 가상 </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> RETINOIC ACID </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY 플레이트 </td><td> NUNC </td><td> 465,219 </td></tr><tr><td> 96 음 문화 플레이트 </td><td> GRENIER </td><td> 655,086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 항체 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> 베타 - III의 TUBULIN 항체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER의 CMXROS </td><td> INVITROGEN </td><td> M - 7512 </td></tr><tr><td> HOECHST - 33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 216763 - 100ML </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> DULBECCO &#39;S 인산염은 염분 버퍼 </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA 마법사 MAGNESIL TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> SHRNA 클론 </td><td> OPEN BIOSYSTEMS </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS의 BIOAPPLICATIONS </td><td> 열 피셔 </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

genomes의 기능 주석, 분자 네트워크 및 소설 약물 표적 식별 건설은 아주 위급 1-4 문제로 해결되어야 할 중요한 과제입니다. 여러 보완 &#39;omics&#39;접근 방식은 유전 위험 요소 및 여러 neurodegenerative 질병을 기본 병원성 메커니즘에 대한 단서를 제공하지만, 대부분의 결과는 아직 기능 검증 5가 필요합니다. 예를 들어, 파킨슨병 (PD), 질병에 대한 위험 요인으로 식별 많은 새로운 loci하지만, 기본 원인이되는 변종 (S) 또는 병원성 메커니즘에 대한 최근의 게놈 넓은 협회 연구는 6, 7을 알 수 없습니다. 각 관련 영역에 여러 개의 유전자를 포함하는 수 있듯이, 전통적인 세포 생물학 기법을 사용하여 질병와 관련된 phenotypes에있는 유전자의 각의 기능 평가 너무 오래 걸립니다. 분자 네트워크를 이해하는 필요도있다는 것을 링크그들은 원인 phenotypes에 유전 변이. 그것은 질병 phenotypes이 중단되었습니다 여러 상호 작용의 결과 것으로 기대된다. 전통적인 분자 방법을 사용하여 이러한 네트워크의 재건은 시간이 소요됩니다. 또한, 개별 구성 요소의 독립적인 연구, reductionism 방식에서 네트워크 예측은 아마 네트워크의 복잡 8 과소 평가합니다. 이 싼 견적이 부분에서 원하지 않는 또는 독성 부작용으로 인해 약물 승인의 낮은 성공률을 설명할 수 있습니다. HT / HC 세포 검사 방법을 사용하여 이러한 경로 내에서 핵심 노드를 식별하는 질병 관련 경로의 네트워크 관점을 확보하면, 치료 개입에 대한 더 적합한 목표의 식별을 초래할 수 있습니다. 하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 9-12 이러한 문제를 해결하기 위해 이상적인 방법입니다. 하지만 전통적인 방법은 simpli를 사용하여 1 차원 전체 - 음 세포​​ assays, 있었다stic 복잡한 생물 학적 과정에 대한 설치 했어요. 그들은 동시에 같은 형태의 속성 13, 14 axonal 교통 결손 또는 변경과 같은 neurodegenerative 질병에서 관찰 많은 phenotypes를 정할 수 없습니다. 이 접근법은 세포의 일부에서 발생 셀룰러 프로세스 또는 병원성 사건의 동적 특성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다. 하나가 다차원 phenotypes로 이동이 이러한 기능을 계량하기 위해서는 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 4, 15-17을 칭했다. HCS는 HTS에 비해 다양한 perturbations에 대한 세포 반응의 자세한 표현을 제공하는 동시에 여러 프로세스의 세포 기반 부량입니다. HCS는 HTS 18, 19 이상의 많은 장점을 가지고 있지만,의 연결 모델에 높은 처리량 (HT) - 높은 콘텐츠 (HC) 화면을 실시하는 것은 인해 높은 비용, 환경 변화와 인간의 오류로 문제가있다. &#39;phenomics&#39;규모의 세포 반응을 감지하기 위해HC 이미지 하나를 사용하여 감도와 재현성을 증가하는 동안 변화하고 오류를 줄일 수있다. 여기에 우리는 정확하고 안정적으로 세포의 연결을 모델로 자동 세포 culturing 20 HC 이미징을 사용하여 shRNA 화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 변이된 것은 autosomal 열성 parkinsonism 21 원인이 하나의 특정 단백질, DJ1에 대한 모듈 레이터를 식별하는이 방법론을 사용한 방법에 대해 설명합니다. HT의 방법으로 HC 이미징의 융통성 결합, 그것은 정확하게 phenotypes의 과다를 정할 수 있습니다. 이것은 이후에뿐만 아니라 잠재적인 치료 표적을 식별로 게놈에 대한 우리의 이해, 질병 pathogenesis에 관련된 경로를 사전에 활용 수 있습니다.

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

우리는 높은 처리량 방식으로, 여러 세포 프로세스와 구조를 시각화하고 수치 높은 콘텐츠를 이미지로 자동 셀 culturing를 결합 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 genomes의 추가 기능 주석의 도움뿐만 아니라 질병 유전자 네트워크 및 잠재적 약물 표적을 식별할 수 있습니다.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K 조회수.  VU University Medical Center. 우리는 높은 처리량 방식으로, 여러 세포 프로세스와 구조를 시각화하고 수치 높은 콘텐츠를 이미지로 자동 셀 culturing를 결합 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 genomes의 추가 기능 주석의 도움뿐만 아니라 질병 유전자 네트워크 및 잠재적 약물 표적을 식별할 수 있습니다.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

연구

의학

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

neurodegenerative 질병의 분석에서 확산 텐서 자기 공명 영상

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.