Ringraziamo i programmatori Hamilton e specialisti per il supporto continuo e Blaas Eva per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da due sovvenzioni agli investimenti NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), Il Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 e il Campus di Neuroscienze di Amsterdam; SJ è supportato da Ti-Pharma: T5-207.

1. Automatizzata aderente cultura processo cellulare (Figura 1) 20 <ol><li> Preparare il sistema automatizzato di coltura cellulare per l&#39;inserimento di piastre di coltura cellulare. Carico di consumo (es. puntali, piastre di coltura cellulare, piatti saggio) nel sistema utilizzando l&#39;interfaccia grafica utente (GUI). Assicurarsi che ci sia sufficiente terreni di coltura cellulare, tampone fosfato (PBS) e tripsina nel sistema robotico. </li><li> Manualmente seme due piastre omnitray con 2 x 10 6 cellule per piastra, delle SH-SY5Y linea di cellule di neuroblastoma. Mantenere le cellule in Opti-MEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Mettere i piatti nel robot coltura cellulare utilizzando la GUI. Le cellule verranno incubate a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Scegliere quale delle cellule protocollo cultura ha bisogno di essere iniziato 20. Si può scegliere tra un processo di coltura cellulare aderente 22, coltura ed espansione di staminali embrionali (ES), le cellule sulle cellule del mouse alimentatore 23 o la coltura di sospensione cells 22. </li><li> Selezionare il protocollo aderente colture cellulari (Figura 1) e garantire aderente cellulare file di parametri specifica linea sono regolate in modo che la soglia di confluenza (l&#39;area del piatto omnitray che contiene le cellule) è fissato al 70%. Impostare il tempo totale tripsinizzazione a due minuti. </li><li> Istruire il robot per preparare piatti omnitray nuovo, con un numero di cellule semina di 2 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Omnitray piastre di ingresso nel sistema di coltura cellulare utilizzando il protocollo automatizzato aderente colture cellulari (Figura 1). Questo protocollo prevede le seguenti fasi: le piastre vengono incubate e ripreso fino a raggiungere la soglia prestabilita, confluenza. Se le cellule non raggiungono la soglia di confluenza entro 5 letture, le piastre vengono rimossi dal sistema. Una volta raggiunta la soglia di confluenza definiti dall&#39;utente, le cellule vengono lavate, trypsinized e contati. Un pre-definito numero di cellule sono aggiunti alle piastre omnitray nuovo e se ci sono un numero sufficiente di cellule, un insensibile specificatoer saggio di piastre vengono trasportati al ponte e un numero definito di cellule erogato in ciascun pozzetto. Piastre di test può essere ripreso direttamente utilizzando il microscopio integrato o di uscita dal sistema per ulteriori elaborazioni. </li><li> Istruire il sistema per preparare 4 piatti test per piastra omnitray, con un totale di 5.000 cellule per pozzetto. </li></ol> 2. shRNA produzione di virus e placcatura in piastre di test (Tempo di percorrenza: 6 giorni) <ol><li> Crescono le scorte glicerolo batterico contenente i vettori shRNA (Open Biosystems, TRC1) pernottamento in 2 ml di Luria-Bertani supporti media contenente 100 mg / ml di ampicilin (Sigma-Aldrich). </li><li> Estratto di plasmidi seguendo il protocollo del produttore (Promega Wizard MagneSil TFX). </li><li> Produrre dei virus mediante RNAi Consorzio High-Throughput Produzione lentivirali (96 pozzetti) protocollo 24. Lavorare con i lentivirus è relativamente sicuro, perché le particelle del virus utilizzato per la trasduzione si replica con deficit e split-strategie di imballaggio gene sono utilizzati per la loro produzione. Tuttavia, quando si lavora con lentivirus, ulteriori procedure di biosicurezza sono necessarie per minimizzare il rischio per se stessi e gli altri 25. Tutti gli esperimenti devono essere condotti in un laboratorio di livello MLII o BSL2 sicurezza. Tutte le plastiche (pipette, piatti di plastica, i media) che sono stati in contatto con particelle di lentivirus devono essere incubate con candeggina per 24 ore prima dello smaltimento. </li><li> Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) del lentivirus determinando la percentuale di cellule GFP positive con il GFP pLKO.1 plasmide (Sigma-Aldrich). </li><li> Lentivirus piastra in piastre di test, con una MOI di 3. </li></ol> 3. Trasduzione lentivirali e la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y (Tempo di percorrenza: 6 giorni) <ol><li> Le cellule sono aggiunti alle piastre test (vedi passo 1.7). Piastre di test di carico contenenti lentivirus shRNA nel sistema automatizzato di coltura cellulare. </li><li> Dopo 24 ore, i media sulpiastre test verrà modificato in Opti-MEM contenente FBS 0,5% e 0,1 mM acido retinoico per iniziare il processo di differenziazione. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y permette la visualizzazione di strutture neuritiche e sincronizza la divisione cellulare. </li><li> Continua l&#39;incubazione delle piastre saggio sui media differenziazione per 5 giorni. Questo assicura la massima knockdown di espressione del gene bersaglio. </li><li> Il giorno 5, aggiungere 50 mM H 2 O 2 alla metà delle piastre test per 24 ore per stimolare la traslocazione di DJ1 ai mitocondri. </li><li> Il giorno 6, aggiungere CmxROS Mitotracker (Invitrogen) alle celle, ad una concentrazione finale di 200 Nm per pozzetto e incubare a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Si può istruire il sistema di piastre immagine direttamente mediante l&#39;imager HC o piastre possono essere esportati dal sistema per ulteriori elaborazioni. </li></ol> 4. Immunocolorazione automatizzata delle piastre test (Tempo di percorrenza: 2 giorni) La qualità dell&#39;immagine è paramount per lo svolgimento di un sensibile e affidabile HCS. Danni al monostrato cellulare a causa di pipettaggio inesatte possono portare a scarsa qualità dell&#39;immagine e dei risultati non riproducibili. Al fine di minimizzare i danni strato di cellule, il immunocolorazione è stata condotta utilizzando una stazione robotica. La procedura è simile a uno che è stato descritto in precedenza 26 ma è stato personalizzato per aumentare la produttività e ridurre l&#39;utilizzo di materiali di consumo. <ol><li> Fissare le cellule con 100 ml di paraformaldeide 4% pre-riscaldato a 37 ° C. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con 200 ml di PBS contenente 0,1% Triton (PBST) per 10 minuti. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con 200 ml di buffer di blocco (PBST con il 5% FBS) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare con il folla causa anticorpi primari notte a 4 ° C: <ol><li> Capra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mcg / ml) </li><li> Coniglio β-III tubulina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> Il giorno seguente, lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con i seguenti anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor 488 asino anti-capra (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 capra anti-coniglio (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le cellule con la Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) per 10 minuti. </li><li> Lavare le cellule con 200 l PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C fino a che non possono essere esposte. </li></ol> 5. Alto contenuto di immagine acquisizione e analisi delle immagini (Tempo richiesto: 5 giorni) <ol><li> Immagine per un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando la lente dell&#39;obiettivo 20x. Visualizza DJ1 con la FITC filtro impostato, i mitocondri con il set TRITC filtro, β-tubulina III con l&#39;insieme Cy5 filtro e dei nuclei utilizzando il set di filtro UV (Figura 3). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando la Bioapplication Compartimentale Analysis (Cellomics, ThermoFisher) per determinare l&#39;intensità media del segnale Mitotracker all&#39;interno dei mitocondri. (Figura 4B, F). </li><li> Per determinare il coefficiente medio di sovrapposizione tra DJ1 ei mitocondri, analizzare le immagini utilizzando la bioapplication Cellomics Colocalisation (Cellomics, ThermoFisher). Definire le aree di interesse (ROI) nel modo seguente: ROI A - nucleo (4A, E), il ROI B - mitocondri (Figura 4 B, F). Escludi ROI ROI A da B per garantire l&#39;analisi di soltanto nel citoplasma. Definire i mitocondri come regione obiettivo I e DJ1 come obiettivo regione II (Figura 4C, G). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando la bioapplication neuronale Profiling (Cellomics, Thermofisher) per tracciare la lunghezza media dei neuriti dal β-tubulina III colorazione (Figura4D, H). </li><li> Piastre immagine utilizzando l&#39;Opera LX automatizzato confocale lettore (Perkin-Elmer). Immagine per un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando la lente 60x obiettivo con immersione in acqua. Visualizza mitocondri con il laser 561 nM e nuclei con eccitazione UV. </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il Spot-Edge-Ridge (SER) texture algoritmo caratteristiche. La SER-Ridge filtro trasmette intensità in pixel che formano cresta simile a modelli. La più frammentati i mitocondri, maggiore è il SER-Ridge score (Figura 8). </li></ol> 6. Normalizzazione dei dati e analisi <ol><li> Importare i dati dal software di analisi delle immagini nel pacchetto Bioconductor CellHTS2 per l&#39;ambiente software R (R versione 2.11.1, la versione Bioconductor 2.6). </li><li> Logaritmo in base (2) trasformare i dati prima di ogni normalizzazione piastra mediana a base 27, 28. Non applicare la regolazione varianza per piastra. </li><li> Per identificare modificatori di un fenotipo, utilizzare due ANOVA strada tra la different i gruppi di trattamento ovvero strapazzate infettate cellule non trattate vs strapazzate tossina cellule trattate rispetto a cellule non trattate rispetto al gene bersaglio le cellule trattate gene bersaglio (figure 5-7). </li></ol> 7. Rappresentante risultati Le mutazioni all&#39;interno DJ1 dar luogo a esordio precoce-recessiva parkinsonismo 21, ma non è chiaro come la perdita di DJ1 dà origine al fenotipo della malattia. E &#39;noto che le cellule carenti di DJ1 sono più suscettibili a stress ossidativo indotto la morte cellulare e nella risposta allo stress ossidativo, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri 29, 30. Mediante la costruzione di test HC di monitorare questi fenotipi, siamo in grado di identificare i geni che regolano o influenzano fenotipi associati con DJ1. Questo approccio può aiutare a decifrare i percorsi all&#39;interno del quale DJ1 funzioni e che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi della malattia. Esempio di interazione con epistatico DJ1 (Figura 5): Atterramento di DJ1 in cellule esposteai risultati tossina in una maggiore perdita di vitalità cellulare (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus strapazzate (BAR-A: image-A). Knockdown del gene bersaglio A ha un effetto simile a quella osservata nelle cellule con un knockdown DJ1 (BAR-C: image-C). Knockdown sia DJ1 e gene bersaglio Un traduce in una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare di perdita di entrambi i geni da soli (BAR-D: image-D). Questo suggerisce una interazione tra epistatico DJ1 e target gene A. Esempio di un gene che regola il DJ1 traslocazione (Figura 6): Quando le cellule sono esposte ad una tossina, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri, che è quantificato da un coefficiente maggiore sovrapposizione tra DJ1 ei mitocondri (BAR-A: image A contro BAR-C: image C). Nelle cellule B in cui gene bersaglio è stato messo a tacere, meno DJ1 trasloca ai mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina. Ciò suggerisce che il gene B obiettivo è coinvolto nel trasporto di DJ1 ai mitocondri. (BAR-B:<html> immagine B e BAR-D: image D) Esempio di un gene coinvolto nella crescita neuronale (Figura 7): Atterramento di C gene bersaglio nel selvaggio tipo SH-SY5Y cellule si traduce in un significativo aumento della lunghezza dei neuriti (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus che esprimono strapazzate shRNA (BAR-A: image A). Questo effetto si perde nelle cellule incubate con tossina (BAR-C e D). Esempio di un gene coinvolto nella morfologia mitocondriale (Figura 8): L&#39;infezione di tipo selvaggio cellule SH-SY5Y con shRNA gene targeting D provocano una diminuzione della mitocondriale SER-Ridge valore di segmentazione (Figura 8, Immagine C e D) rispetto ai cellule infettate con lentivirus strapazzate (Figura 8, Immagine A e B). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Figura 1 Schema di protocollo automatizzato colture cellulari.: ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Figura 2 Schema del processo di screening, l&#39;analisi delle immagini e dei metodi statistici utilizzati durante il processo di screening:. I) Le cellule sono coltivate fino a quando non sono confluenti e successivamente cromato nelle piastre test contenente il lentivirus shRNA. Le cellule sono differenziate per 5 giorni e la tossina viene quindi aggiunta alle piastre per 24 ore. Piastre di test sono uscita dal sistema e immunoistochimica. La quantità di tempo impiegato per ciascuno dei processi è indicato tra parentesi. ii) I dati sono acquisiti mediante un sensore HC (la vitalità delle cellule, proteine ​​e traslocazione escrescenza neuronale) e un imager automatizzato confocale (morfologia mitocondriale). I dati vengono esportati in CellHTS2 pacchetto entro R, base (2) log trasformati e normalizzati. ANOVA a due vie viene utilizzato per identificare interazioni significative tra le diverse variabili. Figura 3. Immagini composite di cellule acquisita da HC imaging. A) le cellule non trattate, B) Le cellule trattate con H 2 O 2. DJ1 è etichettato in verde, i mitocondri in rosso e in blu i nuclei. Colorazione dei neuriti non è evidenziato. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione delle tante caratteristiche cellulari ottenute da un HCS. DC) non trattato cellule SH-SY5Y. EH) H 2 O 2 trattati con cellule SH-SY5Y. A, E) Nuclei segmentazione e la definizione del ROI A, B, F) Identificazione e quantificazione dei mitocondri, ROI B, C, G) Identificazione di DJ1, Target canale II, D, G) Identificazione e calcolo della durata media dei neuriti. Le cellule vicino al bordo dell&#39;immagine sono esclusi dall&#39;analisi. Inset immagini sono immagini prima dell&#39;analisi. <imgalt = &quot;Figura 5.&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Identificazione di un gene in epistasi con DJ1 (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettati con Mitotracker CMXRos (rosso) che è stato utilizzato per la quantificazione della salute delle cellule. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Figura 6. Identificazione di un gene che regola il DJ1 traslocazione (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per DJ1 (verde), mitocondri (rosso) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della traslocazione DJ1 ai mitocondri. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Figura 7. Identificazione di un gene coinvolto nella crescita neuronale (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per la β-III tubulina (verde) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della lunghezza dei neuriti. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Figura 8. Identificazione di un gene coinvolto nella regolazione della morfologia mitocondriale. Immagine A e C sono immagini composite di SH-SY5Y cellule infettate con shRNA strapazzate o un gene targeting shRNA D rispettivamente. I mitocondri sono colorati in rosso, mentre i nuclei sono colorati in blu. Immagine B e D sono visualizzazioni di SER-Ridge quantificazione.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. 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A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare

Con la diminuzione dei costi di HT / HC sistemi di screening cellulari, unita alla disponibilità di potenti genoma strumenti per modificare la funzione del gene, HT / HC schermi stanno diventando comune nel mondo accademico. L&#39;approccio è già stato applicato con successo a diverse aree di ricerca quali l&#39;identificazione di bersagli farmacologici nel cancro 9, 31-33 e 34-36 lo sviluppo embrionale e ha anche potenzialità di applicazione nel decifrare i meccanismi coinvolti nei disordini neuropsichiatrici 37,38. Tuttavia implementazione di tale sistema richiede un investimento significativo di tempo e fatica con l&#39;ottimizzazione dei processi che spesso prende un minimo di 6 mesi. Tutte le fasi, quali i tempi di tripsinizzazione, velocità di pipettaggio e densità di semina devono essere adeguati, per assicurare che le cellule sono sane e crescono costantemente. Prevenzione della contaminazione batterica è una delle sfide più difficili di fronte cultura automatizzata delle cellule con protocolli di pulizia settimanale in combination con risciacquo costante di tutte le linee di rilevamento liquidi con etanolo al 70% sia necessario per la contaminazione delle culture libero. Sarà inoltre necessario migliorare la robotica in modo che gli strumenti aggiuntivi, come microscopi confocale per una maggiore risoluzione e -80 ° C congelatori per la conservazione composto può essere integrato. Ci sono anche limitazioni che devono essere affrontate per migliorare la sensibilità, la velocità e l&#39;utilità di questo metodo per lo studio delle reti geniche e identificare i geni coinvolti nei meccanismi patogeni molecolari. Per condurre un HT / HC schermo e garantire che dati affidabili raccolti, diversi aspetti devono essere ottimizzati. In primo luogo, l&#39;affidabilità della misura è fondamentale e dipende dalla robustezza e la sensibilità del test. Ad esempio, il test sopra descritti sono adatti per schermi di piccole dimensioni, ma sono difficili da implementare su larga scala del genoma, a causa di fasi di lavorazione il numero richiesto prima di acquisizione delle immagini.Quindi, bisognerebbe costruire linee cellulari stabili che esprimono il gene reporter, che consentirebbe per l&#39;imaging diretto e portare a variazioni diminuito a causa del ridotto numero di fasi di lavorazione. Attualmente, la progettazione di un saggio che descrive in modo accurato e affidabile quantifica un fenotipo di interesse è un serio ostacolo nel processo di selezione HC. Molte schermate sono condotti in cellule di mammifero utilizzando diverse librerie di RNAi, che soffrono di off-target effetti, limitata efficienza silenziamento genico e la copertura del genoma incompleto. Così le biblioteche devono essere effettuate, che sono più specifici, potenti e hanno una migliore copertura. Si sta cercando di creare tale si spera tali sforzi a migliorare la riproducibilità di HT / HC SCRE<html> it hits. Una limitazione di scala molti schermi a grandi cellule base è che sono condotti in cellule di neuroblastoma perché possono essere geneticamente manipolate e colto ad un gran numero con relativa facilità. Tuttavia, la rilevanza delle &#39;hit&#39; identificati in modelli ex vivo di coltura cellulare in funzione in vivo è discutibile, soprattutto perché il cervello è composto di tipi di cellule altamente specializzate che formano una fitta rete e complicato delle connessioni sinaptiche di funzionare come unità altamente integrata. Di conseguenza, è frequente che colpisce identificato utilizzando l&#39;approccio di screening di cui sopra, sono convalidati in schermi secondari utilizzando tecniche aggiuntive e in più modelli fisiologici rilevanti 39. Per migliorare la traduzione di visite identificati durante HCS, i modelli più rappresentativi e sofisticati, come le cellule primarie e cellule staminali differenziate o co-coltura sistemi devono essere sviluppati e adattati per HT / HC approcci. ntent &quot;&gt; Con una combinazione di coltura delle cellule automatizzati e HC di imaging si può rapidamente acquisire nuove conoscenze sul modo in cui i neuroni funzione e determinare quali percorsi sono importanti per lo sviluppo della malattia. Combinando HCS / HTS dati con le informazioni generate da altri approcci &#39;omiche&#39;, sarà poi sarà possibile costruire una visione d&#39;insieme biologia dei sistemi di malattie cerebrali, facilitando così lo sviluppo terapeutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Acido Retinoico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY PIASTRE </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 piastre di coltura BENE </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTICORPI </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III TUBULINA ANTICORPI </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER CMXROS </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> HOECHST-33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> FOSFATO Dulbecco Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> ShRNA CLONI </td><td> APERTO BIOSISTEMI </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

L&#39;annotazione funzionale dei genomi, la costruzione di reti molecolari e identificazione di droghe nuovo bersaglio, sono sfide importanti che devono essere affrontati come una questione di grande urgenza 1-4. Molteplici approcci complementari &#39;omiche&#39; hanno fornito indizi utili a capire i fattori di rischio genetici e meccanismi patogenetici alla base di numerose malattie neurodegenerative, ma la maggior parte scoperte richiedono ancora validazione funzionale 5. Per esempio, un recente studio di associazione genome-wide per la malattia di Parkinson (PD), ha individuato loci molti nuovi fattori di rischio per la malattia, ma la variante sottostante causale (s) o meccanismo patogenetico non è noto 6, 7. Come ogni regione associata può contenere diversi geni, la valutazione funzionale di ciascuno dei geni sui fenotipi associati con la malattia, utilizzando le tradizionali tecniche di biologia cellulare sarebbe troppo lungo. Vi è anche una necessità di comprendere le reti molecolari che colleganomutazioni genetiche per i fenotipi che provocano. Si prevede che i fenotipi della malattia sono il risultato di molteplici interazioni che sono state interrotte. La ricostruzione di queste reti con i tradizionali metodi molecolari sarebbe tempo. Inoltre, le previsioni di rete da studi indipendenti di singoli componenti, l&#39;approccio di riduzionismo, probabilmente sottovaluta la complessità della rete 8. Questa sottovalutazione potrebbe, in parte, spiegare il basso tasso di successo di approvazione dei farmaci a causa degli effetti collaterali o tossici. Ottenere una prospettiva di rete di percorsi malattie correlate con HT / HC approcci di screening cellulare e identificare i nodi chiave all&#39;interno di questi percorsi, potrebbe portare alla individuazione di obiettivi che sono più adatti per un intervento terapeutico. High-throughput screening (HTS) è una metodologia ideale per affrontare tali questioni 9-12. ma i metodi tradizionali sono stati uni-dimensionale con tutto il bene saggi cellulari, che utilizzati semplificaSTIC letture per i complessi processi biologici. Essi sono stati in grado di quantificare simultaneamente i fenotipi osservati in molte malattie neurodegenerative, come il deficit di trasporto assonale o alterazioni nelle proprietà morfologia 13, 14. Questo approccio non potrebbe essere utilizzato per indagare la natura dinamica dei processi cellulari o eventi patogeni che si verificano in un sottogruppo di cellule. Per quantificare tali caratteristiche si deve passare al multi-dimensionale fenotipi definito alto contenuto di screening (HCS) 4, 15-17. HCS è la cellula-base quantificazione dei processi contemporaneamente, che fornisce una rappresentazione più dettagliata della risposta cellulare a perturbazioni diverse rispetto a HTS. HCS ha molti vantaggi rispetto HTS 18, 19, ma conducendo una high-throughput (HT)-alto contenuto (HC) schermo nei modelli neuronali è problematico a causa dei costi elevati, variazioni ambientali ed errori umani. Al fine di individuare le risposte cellulari su scala &#39;phenomics&#39;HC utilizzando immagini si deve ridurre le variazioni ed errori, aumentando la sensibilità e riproducibilità. Qui descriviamo un metodo per condurre in modo accurato e affidabile schermi shRNA utilizzando colture di cellule automatizzati 20 e HC di imaging neuronale in modelli cellulari. Ci descrivono come abbiamo utilizzato questa metodologia per identificare modulatori per una particolare proteina, DJ1, che se mutato causa parkinsonismo autosomico recessivo 21. Combinando la versatilità di HC imaging con metodi HT, è possibile quantificare con precisione una pletora di fenotipi. Questo potrebbe essere successivamente utilizzato per far avanzare la nostra comprensione del genoma, i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia e identificare potenziali bersagli terapeutici.

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Noi descriviamo una metodologia che combina coltura automatizzati cella con alto contenuto di imaging per visualizzare e quantificare molteplici processi cellulari e le strutture, in un high-throughput modo. Tali metodi possono aiutare nel ulteriore annotazione funzionale dei genomi, oltre a identificare le reti gene della malattia e potenziali bersagli farmacologici.

Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

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17.4K Views.  VU University Medical Center. Noi descriviamo una metodologia che combina coltura automatizzati cella con alto contenuto di imaging per visualizzare e quantificare molteplici processi cellulari e le strutture, in un high-throughput modo. Tali metodi possono aiutare nel ulteriore annotazione funzionale dei genomi, oltre a identificare le reti gene della malattia e potenziali bersagli farmacologici.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Diffusion Tensor Imaging a risonanza magnetica in Analisi delle Malattie Neurodegenerative

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.

Un test di elettrochemiluminescenza 7-plex ad alta produttività che esegue simultaneamente lo screening per il diabete di tipo 1 e le malattie autoimmuni multiple