Agradecemos aos programadores Hamilton e especialistas para o apoio contínuo e Blaas Eva para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por duas bolsas de Investimento NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 eo Neuroscience Campus Amsterdam; SJ é suportado por Ti-Pharma: T5-207.

1. Processo de cultura de células aderentes automatizado (Figura 1) 20 <ol><li> Preparar o sistema de cultura de células automatizado para a entrada das placas de cultura de células. Consumíveis de carga (por exemplo, pontas de pipeta, placas de cultura celular, placas de ensaio) para o sistema utilizando a interface gráfica do usuário (GUI). Garantir que há meios de cultura de células suficiente, tampão fosfato salino (PBS) e tripsina no sistema robótico. </li><li> Propagar manualmente duas placas omnitray com 2 x 10 6 células por placa, da linhagem de células SH-SY5Y neuroblastoma. Manter as células em Opti-MEM com 10% de soro fetal bovino (FBS). Coloque as placas em cultura de células do robô usando o GUI. As células serão incubadas a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Escolha qual célula protocolo de cultura precisa ser iniciado 20. Pode-se escolher a partir de um processo de cultura de células aderentes 22, cultivo e expansão do tronco embrionárias (ES) células em células de camundongo alimentador 23 ou cultura de suspensão cells 22. </li><li> Selecione o protocolo de cultura de células aderentes (Figura 1) e garantir a aderência de células line arquivos de parâmetros específicos são ajustados para que o limite de confluência (a área da placa omnitray que contém células) é fixado em 70%. Definir o tempo de tripsinização total para dois minutos. </li><li> Instruir o robô a preparar pratos omnitray novo, com um número de celular semeadura de 2 x 10 6 células por placa. </li><li> Placas de entrada omnitray no sistema de cultura celular utilizando o protocolo automatizado cultura de células aderentes (Figura 1). Este protocolo envolve as seguintes etapas: as placas são incubadas e fotografada até atingirem o limite de confluência pré-definidos. Se as células não atingir o limiar confluência dentro de 5 leituras, as placas são removidas do sistema. Ao chegar à confluência limiar definido pelo usuário, as células são lavadas, tripsinizados e contadas. Um número pré-definido de células são adicionados às placas omnitray novo e se houver um número suficiente de células, um numb especificadoer de placas de ensaio são transportados para o convés e um número definido de células dispensada em cada poço. Placas de ensaio pode ser diretamente fotografada usando o microscópio integrados ou saída do sistema para processamento posterior. </li><li> Instruir o sistema para preparar 4 placas de ensaio por placa omnitray, com um total de 5.000 células por poço. </li></ol> 2. shRNA produção de vírus e revestimento em chapas de ensaio (Tempo necessário: 6 dias) <ol><li> Crescer stocks glicerol bacteriana contendo os vetores shRNA (Open Biosystems, TRC1) durante a noite em 2ml de mídia Luria-Bertani meio contendo 100 mg / ml de ampicilina (Sigma-Aldrich). </li><li> Extrato de plasmídeos seguindo o protocolo do fabricante (Promega Assistente MagneSil TFX). </li><li> Produzir vírus usando o RNAi Consórcio de Produção de Alto Throughput Lentivirus (96 placa bem) o protocolo 24. Trabalhando com lentivírus é relativamente seguro, pois as partículas do vírus utilizado para a transdução de replicação são deficientes e split-estratégias de embalagem gene são usados ​​para a sua produção. No entanto, quando se trabalha com lentivírus, procedimentos adicionais de biossegurança são necessárias para minimizar o risco para si mesmo e os outros 25. Todos os experimentos devem ser realizados em um laboratório de nível MLII ou BSL2 segurança. Todos os plásticos (pipetas, pratos de plástico, mídia) que tenham estado em contacto com partículas de lentivírus devem ser incubadas com água sanitária por 24 horas antes da eliminação. </li><li> Calcular a multiplicidade de infecção (MOI) do lentivírus por determinação da percentagem de células GFP positivas usando o GFP pLKO.1 plasmídeo (Sigma-Aldrich). </li><li> Lentivírus placa em placas de ensaio, com uma MOI de 3. </li></ol> 3. Transdução lentiviral e diferenciação neuronal de células SH-SY5Y (Tempo necessário: 6 dias) <ol><li> Células são adicionados às placas de ensaio (ver passo 1.7). Carregar placas de ensaio contendo lentivirus shRNA no sistema automatizado de cultura de células. </li><li> Após 24 horas, os meios de comunicação sobre oplacas de ensaio será alterado para Opti-MEM contendo 0,5% de SFB e 0,1 mM de ácido retinóico para iniciar o processo de diferenciação. Diferenciação de células SH-SY5Y permite a visualização de estruturas neuríticas e sincroniza a divisão celular. </li><li> Continue a incubação das placas de ensaio na mídia diferenciação por 5 dias. Isso garante knockdown máxima da expressão do gene alvo. </li><li> No dia 5, adicionar 50 mM H 2 O 2 a metade das placas de ensaio por 24 horas para estimular a translocação de DJ1 para as mitocôndrias. </li><li> No dia 6, adicione CmxROS Mitotracker (Invitrogen) para as células, a uma concentração final de 200 nM por poço e incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Pode-se instruir o sistema para placas de imagem diretamente usando o gerador de imagens HC ou placas podem ser exportados a partir do sistema para processamento posterior. </li></ol> 4. Imunocoloração automatizada de placas de ensaio (Tempo necessário: 2 dias) Qualidade da imagem é paramount para a realização de uma HCS sensível e confiável. Danos à monocamada celular devido à pipetagem imprecisa pode levar à má qualidade de imagem e os resultados irreproduzíveis. A fim de minimizar os danos camada de células, a imunocoloração foi realizado usando uma estação robótica. O procedimento é similar ao que foi descrito anteriormente 26, mas foi customizado para aumentar o rendimento e reduzir o uso de consumíveis. <ol><li> Fix células com 100 l de paraformaldeído 4% pré-aquecido a 37 ° C. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com 200 mL de PBS contendo Triton 0,1% (PBST) por 10 minutos. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com 200 mL de buffer do bloco (PBST com 5% de FBS) por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incube com o exerdevido anticorpos primários durante a noite a 4 ° C: <ol><li> Cabra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) </li><li> Tubulina coelho β-III (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> No dia seguinte, lave as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com os seguintes anticorpos secundários 1 hora em temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor burro anti-cabra 488 (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor cabra 647 anti-coelho (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Células incube com Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) por 10 minutos. </li><li> Lavar as células com 200 mL PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Placas armazenar a 4 ° C até que possam ser trabalhada. </li></ol> 5. Alto teor de análise de imagem e de aquisição de imagem (Tempo requerido: 5 dias) <ol><li> Imagem um total de 30 campos por bem usar a lente objetiva de 20x. Visualize DJ1 com o FITC conjunto de filtros, a mitocôndria com o conjunto TRITC filtro, β-tubulina III com o conjunto Cy5 filtro e os núcleos usando o conjunto de filtro UV (Figura 3). </li><li> Analisar as imagens usando o Bioapplication Análise compartimental (Cellomics, ThermoFisher) para determinar a intensidade média do sinal Mitotracker dentro da mitocôndria. (Figura 4B, F). </li><li> Para determinar o coeficiente médio de sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias, analisar as imagens usando o bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Definir regiões de interesse (ROI) da seguinte forma: ROI A - núcleo (Figura 4A, E), ROI B - mitocôndria (Figura 4 B, F). A partir de excluir ROI ROI B para garantir a análise de apenas o citoplasma. Definir as mitocôndrias como região alvo I e DJ1 como alvo região II (Figura 4C, G). </li><li> Analisar as imagens usando o bioapplication Profiling Neuronal (Cellomics, Thermofisher) para rastrear os comprimentos médios das neurites da coloração tubulina β-III (Figura4D, H). </li><li> Placas de imagem usando o Opera LX automático confocal leitor (Perkin-Elmer). Imagem um total de 30 campos por bem usar a lente objetiva 60x com imersão em água. Visualize mitocôndrias com o laser 561 nM e núcleos com excitação UV. </li><li> Analisar as imagens usando o ponto-Edge-Ridge (SER) algoritmo características de textura. O filtro SER-Ridge transmite intensidade em pixels formando cume-como testes padrões. Quanto mais fragmentada a mitocôndria, quanto maior a pontuação do SER-Ridge (Figura 8). </li></ol> 6. Normalização de dados e análise <ol><li> Importar os dados do software de análise de imagem no pacote BioConductor CellHTS2 para o ambiente de software R (R versão 2.11.1, versão BioConductor 2.6). </li><li> Logaritmo base (2) transformar os dados antes de por a placa normalização mediana base 27, 28. Não aplicar o ajuste variância por placa. </li><li> Para identificar modificadores de um fenótipo, use uma ANOVA de duas vias entre o diferetratamento nt grupos ou seja, as células infectadas sem tratamento Scrambled vs mexidos células toxina tratada versus células-alvo gene não tratada versus células-alvo gene tratados (Figuras 5-7). </li></ol> 7. Resultados representativos Mutações dentro DJ1 dar origem ao início-início recessive parkinsonismo 21, mas não está claro como a perda de DJ1 dá origem ao fenótipo da doença. Sabe-se que as células deficiente de DJ1 são mais suscetíveis à morte celular induzida pelo estresse oxidativo e na resposta ao estresse oxidativo, DJ1 transloca do citoplasma para a mitocôndria 29, 30. Através da construção de ensaios HC para monitorar esses fenótipos, podemos identificar genes que regulam fenótipos ou afetar associados DJ1. Essa abordagem pode ajudar a decifrar os caminhos em que DJ1 funções e que poderiam estar envolvidos na patogênese da doença. Exemplo de uma interação com epistasia DJ1 (Figura 5): Knockdown de DJ1 em células expostasaos resultados da toxina em uma maior perda de viabilidade celular (BAR-B: image-B) em comparação com as células infectadas com lentivirus mexidos (BAR-A: image-A). Knockdown do gene-alvo A tem um efeito similar ao observado em células com um knockdown DJ1 (BAR-C: image-C). Knockdown de ambos DJ1 e gene-alvo A resulta em uma perda significativamente maior de viabilidade celular do que a perda de qualquer gene sozinho (BAR-D: image-D). Isso sugere uma interação entre epistáticos DJ1 e alvo gene A. Exemplo de um gene regulador DJ1 translocação (Figura 6): Quando as células são expostas a uma toxina, DJ1 transloca do citoplasma para a mitocôndria, que é quantificada por um coeficiente maior sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias (BAR-A: Uma imagem em relação BAR-C: image C). Nas células onde B gene-alvo tem sido silenciada, menos DJ1 transloca para as mitocôndrias, quando as células são expostas à toxina. Isto sugere que B gene-alvo está envolvida no transporte de DJ1 para as mitocôndrias. (BAR-B:<html> imagem B e BAR-D: D imagem) Exemplo de um gene envolvido na conseqüência neuronal (Figura 7): Knockdown do gene C-alvo no tipo selvagem resultados SH-SY5Y células em um aumento significativo no comprimento neurite (BAR-B: image-B) em comparação com as células infectadas com lentivirus expressar scrambled shRNA (BAR-A: Uma imagem). Este efeito é perdido em células incubadas com a toxina (BAR-C e D). Exemplo de um gene envolvido na morfologia mitocondrial (Figura 8): Infecção do tipo selvagem SH-SY5Y células com shRNA visando resultados gene D em uma diminuição no valor segmentação mitocondrial SER-Ridge (Figura 8, Imagem C e D) quando comparado com células infectadas com lentivirus mexidos (Figura 8, Image A e B). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Figura 1 Esboço de protocolo automatizado de cultura de células.: ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Figura 2 Visão esquemática do processo de seleção, análise de imagem e métodos estatísticos utilizados durante o processo de triagem:. I) As células são cultivadas até que sejam confluentes e, posteriormente, banhado nas placas de ensaio contendo o shRNA lentivírus. As células são diferenciadas por 5 dias e toxina é então adicionado as placas por 24 horas. Placas de ensaio estão de saída do sistema e histoquímica. A quantidade de tempo necessário para cada um dos processos está indicado entre parênteses. ii) Os dados são adquiridos utilizando um gerador de imagens HC (a viabilidade celular, a translocação de proteínas e crescimento neuronal) e um sensor de imagem confocal automatizado (morfologia mitocondrial). Os dados são exportados para o pacote dentro CellHTS2 R, base (2) log transformados e normalizados. Two-way ANOVA é usado para identificar interações significativas entre as diferentes variáveis. Figura 3. Composite imagens de células adquiridas pela HC imagem. A) As células não tratadas, B) As células tratadas com H 2 O 2. DJ1 é rotulada de verde, as mitocôndrias em vermelho e os núcleos em azul. Neuritos coloração não é destacada. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificação de várias características celulares obtidos de uma HCS. AD) não tratada SH-SY5Y células. EH) H 2 O 2 tratados SH-SY5Y células. A, E segmentação Núcleos) e definição de ROI A, B, F) Identificação e quantificação das mitocôndrias, ROI B, C, G) Identificação de DJ1, Target canal II; D, G) Identificação e cálculo de comprimento neurite média. Células perto da borda da imagem são excluídos da análise. Inset imagens são imagens antes da análise. <imgalt = &quot;Figura 5&quot;. src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Identificação de um gene em epistasia com DJ1 (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas com Mitotracker CMXRos (vermelho) que foi usado para quantificação de células de saúde. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Figura 6. Identificação de um gene regulador DJ1 translocação (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas para DJ1 (verde), mitocôndrias (vermelho) e núcleos (azul) que foram utilizados para quantificação de DJ1 translocação para a mitocôndria. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Figura 7. Identificação de um gene envolvido na conseqüência neuronal (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas para a β-tubulina III (verde) e núcleos (azul) que foram utilizadas para a quantificação de comprimento neurite. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Figura 8. Identificação de um gene envolvido na regulação da morfologia mitocondrial. Uma imagem e C são imagens compostas de SH-SY5Y células infectadas com shRNA mexidos ou um shRNA alvo gene D, respectivamente. Mitocôndrias são coloridas em vermelho, enquanto os núcleos são coloridos em azul. Imagem B e D são visualizações da quantificação SER-Ridge.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

Não temos nada a divulgar

Com os custos decrescentes de HT / HC sistemas de rastreamento de celular, combinado com a disponibilidade de poderosos genome-wide ferramentas para modificar a função do gene, HT / HC telas estão se tornando comuns na academia. A abordagem já foi aplicado com sucesso em diversas áreas de pesquisa, como a identificação de alvos terapêuticos no câncer 9, 31-33 e 34-36 desenvolvimento embrionário e ainda tem potencial para aplicação em decifrar os caminhos envolvidos em distúrbios neuropsiquiátricos 37,38. No entanto a implementação de tal sistema exige um investimento significativo de tempo e esforço com otimização de processos, muitas vezes tendo um mínimo de 6 meses. Todas as etapas, tais como tripsinização vezes, velocidades e densidades de semeadura pipetagem tem que ser ajustado, para garantir que as células são saudáveis ​​e crescem de forma consistente. Prevenção da contaminação bacteriana é um dos desafios mais difíceis enfrentados cultura de células automatizado semanalmente com os protocolos de limpeza em combination com a constante lavagem de todas as linhas de rolamento líquido com etanol 70% é necessário para a cultura livre de contaminação. Será igualmente necessário melhorar a robótica de forma que instrumentos adicionais, como microscópios confocal de alta resolução e -80 ° C freezers para armazenamento de composto pode ser integrado. Há também limitações que precisam ser tratadas para melhorar a velocidade, sensível e utilidade deste método para estudar redes de gene e identificar genes envolvidos em vias patogênicas molecular. Para conduzir uma tela HT / HC e assegurar que dados confiáveis ​​são coletados, vários aspectos precisam ser otimizados. Primeiro, a confiabilidade da medição é primordial e é dependente da robustez e da sensibilidade do ensaio. Por exemplo, os ensaios acima descritos são adequados para telas menores, mas são difíceis de implementar em uma escala genoma de largura, devido ao número de passos de processamento necessária antes da aquisição da imagem.Assim, seria necessário construir linhas celulares estáveis ​​expressando o gene repórter, o que permitiria a imagem direta e levar a variação diminuiu devido ao número reduzido de etapas de processamento. No presente, projetando um ensaio que retrata com precisão e confiabilidade quantifica um fenótipo de interesse é o principal entrave para o processo de triagem HC. Muitas telas são realizados em células de mamíferos utilizando diferentes bibliotecas RNAi, que sofrem de efeitos fora do alvo, eficiência limitada silenciamento de genes do genoma e cobertura incompleta. Thus bibliotecas precisam ser feitas, que são mais específicos, potentes e têm uma melhor cobertura. Estão em curso esforços para criar tal espera-se tais empreendimentos irão melhorar a reprodutibilidade de HT / HC scre<html> en hits. A limitação de muitas telas de grande escala à base de células é que eles são realizados em células de neuroblastoma, porque eles podem ser manipulados geneticamente e cultivadas para grandes números com relativa facilidade. No entanto, a relevância dos &#39;hits&#39; identificadas na ex vivo modelos de cultura de células para função in vivo é questionável, especialmente porque o cérebro é composto de tipos de células altamente especializadas que formam uma rede densa e complicada de conexões sinápticas funcionar como uma unidade altamente integrado. Como conseqüência, é comum que atinge identificados utilizando a abordagem de triagem descrito acima, são validados em telas secundárias usando técnicas adicionais e mais fisiológico modelos relevantes 39. Para melhorar a tradução de visitas identificadas durante HCS, os modelos mais representativo e sofisticadas, tais como pilhas e células-tronco diferenciadas ou co-cultura sistemas precisam ser desenvolvidos e adaptados para HT / HC abordagens. &gt; ntent &quot;Com uma combinação de cultura de células automatizado e imagem HC pode rapidamente obter novos insights sobre como os neurônios de função e determinar quais as vias são importantes para o desenvolvimento da doença. Combinando HCS / HTS dados com informações geradas a partir de outras abordagens a genómica, que vai então, ser possível construir uma visão de biologia de sistemas de doenças cerebrais, facilitando assim o desenvolvimento terapêutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Ácido Retinóico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> PLACAS OMNITRAY </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 BEM placas de cultura </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 ANTICORPO N20 </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III ANTICORPO tubulina </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> CMXROS MITOTRACKER </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> HOECHST-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> TRIPSINA </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> FOSFATO Dulbecco Tampão Salina </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> Plasmideo CLONES </td><td> Open Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> BIOAPPLICATIONS CELLOMICS </td><td> THERMO FISHER- </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

A anotação funcional de genomas, construção de redes e identificação molecular romance alvo da droga, são desafios importantes que precisam ser tratadas como uma questão de grande urgência 1-4. Múltiplas abordagens complementares a genómica forneceram pistas sobre os fatores de risco genéticos e mecanismos patogênicos subjacentes inúmeras doenças neurodegenerativas, mas a maioria dos achados ainda necessitam de validação funcional 5. Por exemplo, um recente estudo de associação genômica ampla para a Doença de Parkinson (DP), identificou muitos loci novos fatores de risco para a doença, mas a variante subjacente causal (s) ou mecanismo patogênico não é conhecida 6, 7. Como cada região associada pode conter vários genes, a avaliação funcional de cada um dos genes em fenótipos associados com a doença, utilizando técnicas de biologia celular tradicional levaria muito tempo. Há também uma necessidade de compreender as redes moleculares que apontammutações genéticas para os fenótipos que elas causam. Espera-se que fenótipos da doença são o resultado de múltiplas interações que foram rompidas. Reconstrução dessas redes usando os tradicionais métodos moleculares seria demorado. Além disso, as previsões de rede de estudos independentes de componentes individuais, a abordagem reducionista, provavelmente subestimam a complexidade da rede 8. Essa subestimação poderia, em parte, explicar a baixa taxa de sucesso de aprovação da droga devido aos efeitos colaterais indesejáveis ​​ou tóxicos. Ganhando uma perspectiva de rede de vias de doenças relacionadas com HT / HC abordagens de triagem celular, e identificar os nós-chave dentro dessas vias, poderiam levar à identificação de alvos que são mais adequados para a intervenção terapêutica. High-throughput screening (HTS) é uma metodologia ideal para abordar estas questões 9-12. mas os métodos tradicionais foram unidimensional ensaios de todo o bem celular, que usava simplistic leituras de processos biológicos complexos. Eram incapazes de quantificar simultaneamente os fenótipos observados em muitas doenças neurodegenerativas, tais como déficits de transporte axonal ou alterações nas propriedades morfologia 13, 14. Esta abordagem não poderia ser usado para investigar a natureza dinâmica de processos celulares ou eventos patogênicos que ocorrem em um subconjunto de células. Para quantificar tais características tem de se mudar para multi-dimensional fenótipos denominado de alto teor de triagem (HCS) 4, 15-17. HCS é a quantificação baseada em células de vários processos simultaneamente, o que fornece uma representação mais detalhada da resposta celular a perturbações diversas em relação ao HTS. HCS tem muitas vantagens sobre HTS 18, 19, mas a realização de um high-throughput (HT) de alta o conteúdo da tela (HC) em modelos neuronal é problemático devido ao alto custo, a variação ambiental e erro humano. A fim de detectar respostas celulares em uma escala &#39;phenomics&#39;usando uma imagem HC tem que reduzir a variação e erro, enquanto aumentando a sensibilidade e reprodutibilidade. Aqui nós descrevemos um método para realizar com precisão e confiabilidade telas shRNA utilizando cultura de células automatizado 20 e HC de imagem em modelos celulares neuronais. Descrevemos como nós usamos esta metodologia para identificar moduladores de uma determinada proteína, DJ1, que quando mutado causa parkinsonismo autossômica recessiva 21. Combinando a versatilidade do HC de imagem com métodos de HT, é possível quantificar com precisão um grande número de fenótipos. Esta situação pode ser utilizada para fazer avançar a nossa compreensão do genoma, os caminhos envolvidos na patogênese da doença, bem como identificar potenciais alvos terapêuticos.

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Nós descrevemos uma metodologia que combina cultura de células automatizado com alto conteúdo de imagem para visualizar e quantificar vários processos celulares e estruturas, de uma forma de alto rendimento. Tais métodos podem auxiliar na anotação de genomas ainda mais funcional, bem como identificar redes de doença genética e alvos terapêuticos potenciais.

Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K visualizações.  VU University Medical Center. Nós descrevemos uma metodologia que combina cultura de células automatizado com alto conteúdo de imagem para visualizar e quantificar vários processos celulares e estruturas, de uma forma de alto rendimento. Tais métodos podem auxiliar na anotação de genomas ainda mais funcional, bem como identificar redes de doença genética e alvos terapêuticos potenciais.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Medicina

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Diffusion Tensor Imagem por Ressonância Magnética na Análise de Doenças Neurodegenerativas

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.