Hamilton programcılar ve uzman teknik yardım için sürekli destek ve Eva Blaas için teşekkür ederiz. T5-207: SJ Ti-Pharma tarafından desteklenen; Bu çalışma iki NWO Yatırım hibe (911-07-031 ve 40-00506-98-10011), Prinses Beatrix Viyana Wetenschapsprijs 2009 ve Nörobilim Kampüsü Amsterdam tarafından desteklenmiştir.

1. Otomatik yapışık hücre kültürü süreci (Şekil 1) 20 <ol><li> Hücre kültürü plakaların girişi için otomatik hücre kültür sistemi hazırlayın. Yük sarf malzemeleri (örneğin pipet uçları, hücre kültürü plakaları, tahlil tabak) grafik kullanıcı arayüzü (GUI) kullanarak sistemi. Yeterli hücre kültür ortamı var olun, fosfat tamponlu salin (PBS) ve tripsin robotik sistem. </li><li> SH-SY5Y nöroblastom hücre hattı plaka başına 2 x 10 6 hücre, el ile tohum iki omnitray plakalar. Opti-MEM hücrelerin% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile koruyun. GUI kullanarak hücre kültürü robot tabak koyun. Hücreler 37 ° C ve% 5 CO 2 &#39;de inkübe olacaktır . </li><li> Kültür protokolü hangi hücrenin 20 başlatılan gerektiğini seçin. Bir yapışık, hücre kültürü süreci 22, kültür ve fare besleyici hücreler 23 veya süspansiyon cel kültür embriyonik kök (ES) hücrelerinin genişlemesi seçebilirls 22. </li><li> Yapışık hücre kültürü protokolü (Şekil 1) seçin ve yapışık hücre hattı spesifik parametre dosyaları izdiham eşik değeri% 70 olarak belirlenmiştir (hücreleri içeren omnitray plaka alan) olacak şekilde ayarlanır. Sağlamak. Iki dakika toplam trypsinization zaman ayarlayın. </li><li> Plaka başına 2 x 10 6 hücre tohumlama hücre sayısı, yeni omnitray plakaları hazırlamak için robot bilgilendirin. </li><li> Hücre kültür sistemi otomatik yapışık hücre kültürü protokolü (Şekil 1) kullanarak girdi omnitray plakalar. Bu protokol, aşağıdaki adımları içerir: plakaları inkübe ve önceden tanımlanmış izdiham eşik ulaşana kadar görüntülü. Hücreler 5 okuma içinde izdiham eşik ulaşmak yoksa, tabak sistemden kaldırılır. Kullanıcı tanımlı izdiham eşik ulaştıktan sonra, hücre, yıkanmış tripsinize ve sayılır. Hücrelerin önceden tanımlanmış bir sayıda yeni omnitray plakaları eklendi ve hücrelerin yeterli sayıda, belirli bir uyuşma varsatahlil plakaları er güverte taşınır ve belirli bir hücre sayısı her kuyuya vazgeçtik. Testi plakaları doğrudan, daha fazla işlem için sistem entegre bir mikroskop veya çıkış kullanarak görüntülü olabilir. </li><li> Ortalama 5.000 hücrelerinin toplam 4 omnitray plaka başına tahlil plaka hazırlamak için sistem bilgilendirin. </li></ol> 2. tahlil tabak içine shRNA virüs üretim ve kaplama (gerekli Zaman: 6 gün) <ol><li> Ampisilin 100 mg / ml (Sigma-Aldrich) içeren Luria Bertani orta medya 2ml gecede shRNA vektörler (Açık Biyosistem, TRC1) içeren bakteriyel gliserol stokları büyütün. </li><li> Üretici protokolü (Promega Sihirbazı MagneSil TFX) plazmid ayıklayın. </li><li> RNAi Konsorsiyumu High-Throughput lentiviral Üretim (96 plaka) 24 protokolü kullanarak virüs üretin. Transdüksiyon için kullanılan virüs parçacıkları çoğaltma eksiktir ve bölünmüş çünkü lentivirüs ile Çalışma nispeten güvenligen ambalaj stratejileri, kendi üretimi için kullanılır. Ancak, lentivirüs ile çalışırken, ek biyogüvenlik prosedürleri kendini ve diğerleri 25 riskini en aza indirmek için gerekli. Tüm deneyler MLII veya BSL2 güvenlik düzeyi laboratuvarda yapılmalıdır. Lentivirüs parçacıkları ile temas halinde olan tüm plastik (pipetler, plastik tabaklar, medya), tasfiye etmeden önce, 24 saat çamaşır suyu ile inkübe edilmelidir. </li><li> Plazmid pLKO.1 GFP (Sigma-Aldrich) kullanarak GFP pozitif hücrelerin yüzdesi belirleyerek lentivirüs enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplayın. </li><li> 3 bir İçişleri Bakanlığı ile tahlil tabak içine Plaka lentivirüs. </li></ol> 3. Lentiviral iletimi ve SH-SY5Y hücreleri (gerekli Zaman: 6 gün) nöronal farklılaşma <ol><li> Hücreleri (1.7 adım bakınız) tahlil plakaları eklenir. Otomatik hücre kültürü sistemi shRNA lentivirüs içeren tahlil tabak yerleştirin. </li><li> 24 saat sonra, medyatahlil plakalar% 0.5 FBS ve farklılaşma sürecine başlamak için 0.1 mcM retinoik asit içeren Opti-MEM değişmiş olacaktır. SH-SY5Y hücrelerin farklılaşması nöritik yapıların görüntülenmesini sağlar ve hücre bölünmesi eşitler. </li><li> 5 gün boyunca farklılaşma medya test plakaları inkübasyon devam edin. Bu hedef gen ekspresyonu maksimum demonte sağlar. </li><li> 5 gün, mitokondri DJ1 translokasyonu teşvik etmek için 24 saat boyunca test plakaların yarısı 50 mcM H 2 O 2 ekleyin. </li><li> 6 gün, yanı başına 200 nM final konsantrasyonda hücrelere Mitotracker CmxROS (Invitrogen) ekleyin ve 37 ° inkübe ° C&#39;de 30 dakika. </li><li> Bir sistem doğrudan HC görüntüleyici veya plakaları daha fazla işlem için sistem ihraç edilebilir kullanarak görüntü plakaları talimat verebilirsiniz. </li></ol> 4. Tahlil plakaları otomatik olarak immün (gerekli Zaman: 2 gün) Görüntü kalitesi paramounduyarlı ve güvenilir bir HCS yürütülmesi için t. Yanlış pipetleme nedeniyle hücresel tek tabaka hasar, kötü görüntü kalitesine ve irreproducible sonuçları yol açabilir. Hücre tabakası hasarı en aza indirmek için, immün bir robot istasyonu kullanılarak yapıldı. Bu prosedür, daha önce 26 olan birine benzer ama verimi arttırmak ve sarf malzeme kullanımını azaltmak için özelleştirilmiş oldu. <ol><li> 100 4% paraformaldehid 37 ul önceden ısıtılmış ° C hücreleri saptamak Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 5 dakika, 3 kez PBS ile 200 ul hücreleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca% 0,1 Triton (PBST) içeren PBS 200 ul tahlil plakaları inkübe edin. </li><li> 5 dakika, 3 kez PBS ile 200 ul hücreleri yıkayın. </li><li> Tahlil plakaları oda sıcaklığında 1 saat için blok tampon 200 ul (% 5 FBS ile PBST) ile inkübe edin. </li><li> 5 dakika, 3 kez PBS ile 200 ul hücreleri yıkayın. </li><li> Foll ile inkübe4 geceleme nedeniyle primer antikor ° C <ol><li> Keçi DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) </li><li> Tavşan β-III tubulin (Sigma-Aldrich, 1 mcg / ml) </li></ol></li><li> Ertesi gün, 5 dakika, 3 kez PBS ile 200 ul hücreleri yıkayın. </li><li> Tahlil plakaları oda sıcaklığında aşağıdaki sekonder antikor 1 saat inkübe <ol><li> AlexaFluor 488 eşek anti-keçi (Invitrogen, 2 mcg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 keçi anti-tavşan (Invitrogen, 2 mcg / ml </li></ol></li><li> 5 dakika, 3 kez PBS ile 200 ul hücreleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca; Hoechst (1 mcg / ml Invitrogen) ile inkübe hücreleri. </li><li> 200 ul PBS ile 3 kez 5 dakika, hücreleri yıkayın. </li><li> Plakları, 4 ° C &#39;ye kadar görüntülenebilir. </li></ol> 5. (Zaman: 5 gün) içeriği yüksek görüntü elde etme ve görüntü analizi <ol><li> Toplam 20x objektif lens ile de ortalama 30 alan bir görüntü. FI ile DJ1 görselleştirinTC filtre seti, TRITC filtre seti, Cy5, filtre seti ve UV filtre seti (Şekil 3) kullanarak çekirdekleri β-III tubulin mitokondri. </li><li> Mitokondri içinde Mitotracker sinyali ortalama yoğunluğunu belirlemek için komparmantal Analizi Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) kullanarak görüntüleri analiz edin. (Şekil 4B, F). </li><li> DJ1 ve mitokondri arasındaki ortalama örtüşme katsayısı belirlemek için, Cellomics Colocalisation bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) kullanarak görüntüleri analiz eder. Aşağıdaki gibi ilgi alanları (ROI) tanımlayın: ROI A - nükleus (Şekil 4A, E), YG B - mitokondri (Şekil 4 B, F). Sadece sitoplazma analizi sağlamak için ROI B ROI A dışlayın. Mitokondri hedef bölge olarak hedef bölge II (Şekil 4C, G) I ve DJ1 olarak tanımlayın. </li><li> Β-III tubulin boyama (Şekil neurites ortalama uzunlukları iz Nöronal Profil bioapplication (Cellomics, Thermofisher) kullanarak görüntüleri analiz4D, H). </li><li> Opera LX otomatik konfokal okuyucu (Perkin-Elmer) kullanarak görüntü plakalar. Suya daldırma ile 60x objektif lens kullanarak ortalama 30 alanların toplam görüntü. UV eksitasyon ile 561 nM lazer ve çekirdekleri ile mitokondri gözünüzde canlandırın. </li><li> Spot-Kenar-Ridge (SER) doku özellikleri algoritması kullanarak görüntüleri analiz edin. SER-Ridge filtre sırtı benzeri desenler oluşturan piksel yoğunluğu iletir. Daha fazla parçalanmış mitokondri, yüksek SER-Ridge skoru (Şekil 8). </li></ol> 6. Veri normalleşme ve analiz <ol><li> R yazılım ortamı için BioConductor CellHTS2 paketi (R sürüm 2.11.1, BioConductor sürüm 2.6), görüntü analiz yazılımı, veri içe aktarın. </li><li> Logaritma tabanı (2) plaka başına medyan temelli normalleşme 27, 28 öncesinde verileri dönüştürmek. Plaka başına varyansın ayarlaması uygulama yapmayınız. </li><li> Bir fenotip değiştiriciler tanımlamak için, differe arasında iki yönlü ANOVAnt tedavi gruplarında yani virüslü tedavi edilmezse hücreleri Şifreli vs şifreli toksin muamele edilen hücreler hedef gen tedavi edilmezse hücreleri vs vs hedef gen tedavi hücreleri (Şekil 5-7). </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları Mutasyonlar DJ1 içinde erken başlangıçlı resesif parkinsonizm 21 doğuran, ama DJ1 kaybı hastalığın fenotipi yol açmaktadır nasıl belli değildir. DJ1, eksik hücreleri oksidatif strese bağlı hücre ölümü daha duyarlı ve oksidatif stres, mitokondri 29 sitoplazma DJ1 translocates, 30 yanıt olduğu bilinmektedir. Bu fenotipleri izlemek için HC testleri inşa ederek, biz DJ1 ile ilişkili fenotipleri düzenleyen veya etkileyen genler tespit edebilir. Bu yaklaşım, deşifre DJ1 fonksiyonları ve hastalık patogenezinde içinde yer almış olabilir yollar yardımcı olabilir. Epistatik DJ1 ile bir etkileşim (Şekil 5) Örnek: maruz kalan hücrelerde, demonte DJ1Görüntüyü hücre canlılığı büyük bir kaybı toksin sonuçları (BAR-B:-B) şifreli lentivirüs ile enfekte hücrelere kıyasla (BAR-A: image-A). Hedef gen demonte DJ1 demonte (image-C BAR-C) ile hücrelerinde gözlenen benzer bir etkiye sahiptir. DJ1 ve hedef genin sadece iki genin kaybı (image-Ge BAR-D) göre anlamlı olarak daha fazla hücre canlılığı kaybı sonuçları demonte. Bu epistatik DJ1 ve hedef gen A. arasında bir etkileşim de anlaşılacağı Örnek hücreleri bir toksine maruz sitoplazma mitokondri DJ1 translocates DJ1 arasında daha yüksek bir örtüşme katsayısı ve mitokondri (BAR-A sayısal:: resim, bir karşı DJ1 translokasyon (Şekil 6) düzenleyen bir gen BAR-C: image C). B hedef gen susturulması olmuştur hücreler, daha az mitokondri DJ1 translocates hücreleri toksine maruz zaman. Bu hedef geni B mitokondri DJ1 taşınması yer almaktadır göstermektedir. (BAR-B:<html> görüntü B ve BAR-D: image D) Neurite uzunluğunda önemli bir artış vahşi tip SH-SY5Y hücreleri hedef gen C demonte: nöronal akıbet (Şekil 7) yer alan bir gen Örnek görüntü (BAR-B:-B), şifreli ifade lentivirüs ile enfekte hücreleri ile karşılaştırıldığında shRNA (BAR-A: Resim A). Bu etki, toksin (BAR-C ve D) ile inkübe hücreleri kaybolur. Mitokondriyal morfolojisi (Şekil 8) yer alan bir gen Örnek: Enfeksiyon mitokondriyal SER-Ridge segmentasyonu değeri (Şekil 8, Resim C ve D) bir azalma gen-Ge sonuçlarını hedef shRNA vahşi tip SH-SY5Y hücreleri ile karşılaştırıldığında hücreleri şifreli lentivirüs (Şekil 8, Resim A ve B) ile enfekte. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Şekil 1 otomatik hücre kültürü protokol Taslağı: ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Şekil 2, tarama sürecinin şematik bakış, görüntü analizi ve tarama işlemi sırasında kullanılan istatistiksel yöntemler: shRNA lentivirüs içeren test plakaları içine belirsiz ve sonradan kaplama kadar i) Hücreler kültür. Hücreler, 5 gün boyunca farklı ve toksin sonra 24 saat boyunca plakaları eklenir. Testi plakaları sistemden çıkış ve immunohistokimyasal. Süreçlerinin her biri için alınan zamanın miktarı parantez içinde gösterilir. ii) Veri HC görüntüleyici (hücre canlılığı, protein translokasyon ve nöronal akıbet) ve otomatik bir konfokal görüntüleyici (mitokondriyal morfoloji) kullanılarak elde edilir. Veri R CellHTS2 paketi içinde ihraç edilmektedir, baz (2) değiştirdi ve normalize giriş. İki yönlü ANOVA farklı değişkenler arasındaki önemli etkileşimi tanımlamak için kullanılır. Şekil 3 HC görüntüleme ile elde edilen hücreler kompozit görüntüler. A) Tedavi edilmeyen hücreleri, B) Hücreler H 2 O 2 ile tedavi. DJ1, yeşil, kırmızı ve mavi çekirdekleri mitokondri etiketlenmiştir. Neurite boyama vurgulu değildir. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Şekil 4 bir HCS elde edilen çok sayıda cep telefonu özellikleri Kantitasyonu . AD) Tedavi edilmemiş SH-SY5Y hücreleri. EH) H 2 O 2 tedavi SH-SY5Y hücreler. ROI A, E) Çekirdekler segmentasyonu ve tanımı; mitokondri, YG B, B, F) tanımlanması ve ölçülmesi, C, G) DJ1 belirlenmesi, Hedef kanal II; ortalama neurite uzunluğu D, G) Tanımlama ve hesaplama. Görüntünün kenarına yakın Hücreler analize dahil. Ankastre görüntüleri analizden önce görüntüleri. <imgalt = &quot;Şekil 5.&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Şekil 5 DJ1 (çubukları üzerinde harfler, resimlere yazı karşılık) ile epistasis bir gen belirlenmesi . Görüntüler D yoluyla hücre sağlığı ölçümü için kullanılan Mitotracker CMXRos (kırmızı) ile etiketli SH-SY5Y hücrelerdir. <img alt="Şekil 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Şekil 6 DJ1 translokasyon (resimlere yazı karşılık barlarda harf) düzenleyen bir gen belirlenmesi. Görüntüler D yoluyla mitokondri DJ1 translokasyon ölçümü için kullanılan mitokondri DJ1 (yeşil), (kırmızı) ve çekirdekler (mavi) etiketli SH-SY5Y hücrelerdir. <img alt="Şekil 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Şekil 7 nöronal akıbet yer alan bir gen belirlenmesi (resimlere yazı karşılık barlarda harf). A ile D arasındaki neurite uzunluk ölçümü için kullanılan β-III tubulin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) etiketli SH-SY5Y hücreleri görüntüler. <img alt="Şekil 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Şekil 8 mitokondriyal morfolojisi düzenleyen bir gen belirlenmesi. Resim A ve C sırasıyla şifreli shRNA veya shRNA hedef geni D ile enfekte olan SH-SY5Y hücrelerinin kompozit görüntüler. Çekirdekleri mavi renkli iken Mitokondri kırmızı renklidir. Resim B ve D SER-Ridge kantifikasyon görselleştirme.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461, 908-915 (2009).</li><li>Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+'omic'+information:+a+bridge+between+genomics+and+systems+biology.">Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology.</a> Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).</li><li>Zhu, H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Omic'+approaches+for+unraveling+signaling+networks.">'Omic' approaches for unraveling signaling networks.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68, 207-217 (2010).</li><li>Manolio, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Nalls, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson's+disease:+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies.">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377, 641-649 (2011).</li><li>Simon-Sanchez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+confirms+extant+PD+risk+loci+among+the+Dutch.">Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch.</a> Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).</li><li>Van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductionism+and+complexity+in+molecular+biology.+Scientists+now+have+the+tools+to+unravel+biological+and+overcome+the+limitations+of+reductionism.">Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism.</a> EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).</li><li>Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+needle+in+the+haystack:+why+high-throughput+screening+is+good+for+your+health.">Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health.</a> Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Introduction: cell-based assays for high-throughput screening.</a> Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).</li><li>Conrad, C., Gerlich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscopy+for+high-content+RNAi+screening.">Automated microscopy for high-content RNAi screening.</a> J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).</li><li>Thomas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening:+a+decade+of+evolution.">High-content screening: a decade of evolution.</a> J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+in+neuroscience.">High-content analysis in neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).</li><li>Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+neurodegeneration+and+complex+disease+phenotypes.">High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).</li><li>Durr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hit+identification+by+quality+assurance+and+multivariate+data+analysis+of+a+high-content,+cell-based+assay.">Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay.</a> J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationships+between+huntingtin+levels,+polyglutamine+length,+inclusion+body+formation,+and+neuronal+death+provide+novel+insight+into+huntington's+disease+molecular+pathogenesis.">Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis.</a> J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).</li><li>Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Automation+of+Cell+Culture.">The Complete Automation of Cell Culture.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).</li><li>Bonifati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DJ-1+gene+associated+with+autosomal+recessive+early-onset+parkinsonism.">Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism.</a> Science. 299, 256-259 (2003).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+Subculturing+Mammalian+Cells.">Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen.">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124, 1283-1298 (2006).</li><li>Volksgezondheid, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrale+versie+van+de+Regeling+genetisch+gemodificeerde+organismen+en+het+Besluit+genetische+gemodificeerde.">Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde.</a> Organismen. , (2004).</li><li>Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+and+Astrocyte+Co-Culture+Assay+for+High+Content+Analysis+of+Neurotoxicity.">A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity.</a> J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).</li><li>Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var

Gen işlevini değiştirmek için güçlü bir genom araçlarının durumu ile kombine HT / HC hücresel tarama sistemleri, azalan maliyetler, HT / HC ekranlar akademide olağan hale gelmiştir. Bu yaklaşım zaten başarıyla araştırma, kanser 9, 31-33 ve embriyonik gelişim 34-36 ilaç hedeflerinin belirlenmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanan ve hatta nöropsikiyatrik hastalıklarda 37,38 dahil yollar deşifre uygulama potansiyeline sahiptir. Ancak böyle bir sistemin uygulanması, genellikle en az 6 aylık bir süreç optimizasyonu ile zaman ve çaba önemli bir yatırım gerektirir. Trypsinization kez pipetleme hızları ve ekim yoğunlukları gibi tüm adımlar, hücrelerin sağlıklı olmasını sağlamak ve sürekli büyümeye ayarlanması gerekir. Bakteriyel kontaminasyonun önlenmesi, c haftalık temizlik protokolleri ile otomatik hücre kültürü karşılaştığı en zor durumlardan birikirlenme ücretsiz kültürler için gerekli olan% 70 etanol ile tüm sıvı taşıyan hatların sabit durulama ile ombination. Bu robotik geliştirmek için de gerekli olacak, böylece, yüksek çözünürlük ve -80 ° C derin dondurucular bileşik depolama için entegre edilebilir konfokal mikroskoplar gibi ek araçlar. Gen ağları çalışma ve patojenik moleküler yolaklar ilgili genleri tanımlamak için bu yöntemi duyarlı, hızlı ve faydalı artırmak için ele alınması gereken sınırlamalar da vardır. HT / HC ekran davranış ve güvenilir veri toplanmış olduğundan emin olmak için, çeşitli yönleriyle optimize edilmiş olması. İlk olarak, ölçüm güvenilirliği çok önemlidir ve sağlamlık ve duyarlılık testinin bağlı. Örneğin, yukarıda açıklanan deneyleri, küçük ekranlar için uygundur, ancak görüntü elde etme önce gerekli sayı işleme adımları nedeniyle geniş çaplı bir genom, uygulamak zor.Böylece, doğrudan görüntüleme için izin ve işlem adımları az sayıda nedeniyle azalmış varyasyon yol açacak muhabiri gen ifade istikrarlı hücre hatları inşa etmek olurdu. Şu anda, doğru bir tasvir ve güvenilir bir ilgi fenotipi HC tarama sürecinin büyük bir darboğaz olduğunu rakamlarla bir test tasarımı. Birçok ekranlarında-hedef dışı etkileri sınırlı gen susturulması verimlilik ve eksik genom kapsama muzdarip her biri farklı RNAi kütüphaneler, memeli hücreleri kullanılarak yapılmaktadır. Böylece kütüphaneler, daha spesifik, güçlü ve daha iyi bir kapsama sahip olduğu yapılması gerekir. Oluşturmak için çalışmalar devam etmektedir bu tür bu tür çabalar İY / HC scre tekrarlanabilirliğini artıracak umulmaktadır<html> tr vurur. Onlar genetik göreli kolaylıkla manipüle ve çok sayıda etmek için kültürü, çünkü birçok büyük ölçekli hücre tabanlı ekranlar bir sınırlama nöroblastom hücrelerinde yapılır. Ancak, in vivo fonksiyonu, ex-vivo hücre kültürü modelleri tanımlanan &#39;hit&#39; alaka beyin sinaptik bağlantıların fonksiyonu için son derece entegre bir birim olarak yoğun ve karmaşık bir ağ oluşturan son derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur, özellikle de sorgulanabilir. Sonuç olarak, yukarıda açıklanan tarama yaklaşımı kullanılarak belirlenen ek teknikler kullanılarak ikincil ekranları ve daha fizyolojik ilgili modelleri 39 valide Vurduğu yaygındır. HCS sırasında tanımlanan çeviri hit artırmak için, birincil hücre ve farklılaşmış kök hücreler ya da ko-kültür sistemleri gibi daha temsili ve sofistike modelleri, İY / HC yaklaşımlar için geliştirilen ve adapte olması gerekir. otomatik hücre kültür ve HC görüntüleme tek bir kombinasyonu ile ntent &quot;&gt; nöron fonksiyonu nasıl içine hızla yeni anlayışlar kazanmak ve hangi yollar hastalık gelişiminde önemli &#39;diğer omics&#39; yaklaşımlar elde edilen bilgiler ile HCS / HTS verileri birleştiren belirlemek, sonra beyin hastalıkları bir sistem biyolojisi genel bakış oluşturmak için, böylece tedavi gelişimi kolaylaştırmak mümkün.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Retinoik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY LEVHALARI </td><td> Nunc </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 KUYU Kültür LEVHALARI </td><td> Grenier </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTİKOR </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III tubulin ANTİKOR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER CMXROS </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> HOECHST-33.342 </td><td> Invitrogen </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> Hidrojen peroksit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216.763-100ML </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuz </td><td> Invitrogen </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> Promega SİHİRBAZI MAGNESIL TFX </td><td> Promega </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> SHRNA klonların </td><td> AÇIK Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-Fisher </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

Genomların işlevsel açıklama, inşaat, moleküler ağlar ve yeni ilaç hedef tanımlama 1-4 ehemmiyetli bir mesele olarak ele alınması gereken önemli sorunlar olarak karşımıza çıkıyor. Çoklu tamamlayıcı &#39;omics yaklaşımları, genetik risk faktörleri ve birçok nörodejeneratif hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaları olarak ipuçları vermiş, ancak en bulgular hala işlevsel doğrulama 5 gerektirir . Örneğin Parkinson Hastalığı (PH) hastalığı için risk faktörü olarak tanımlanan pek çok yeni lokusların, ancak altta yatan etken varyant (ler) veya patojenik mekanizma için yeni bir genom ilişki çalışmasında, 6, 7 bilinmemektedir. Ilişkili her bölgede birçok gen içerebileceği gibi, hücre biyolojisi, geleneksel teknikleri kullanarak, hastalığı ile ilişkili fenotipleri genlerin her biri işlevsel bir değerlendirme çok uzun sürecektir. Moleküler ağlar anlamak için de ihtiyaç vardır bu bağlantıyıneden fenotipleri genetik mutasyonlar. Bu hastalık fenotipleri bozulmuştur birden fazla etkileşimlerin sonucu olduğunu bekleniyor. Geleneksel moleküler yöntemler kullanılarak bu ağların İmar zaman alıcı olacaktır. Ayrıca, ağ bileşenleri tek tek bağımsız çalışmalar, indirgemecilik yaklaşım, tahminler, muhtemelen ağ karmaşıklığını 8 hafife . Bu, kısmen, küçümsenmesi, istenmeyen ya da toksik yan etkileri nedeniyle ilaç onayı düşük başarı oranı ile açıklanabilir. İY / HC hücresel tarama yaklaşımları kullanarak, bu yollar içinde anahtar düğümleri tanımlamak hastalığı ile ilgili yollarının bir ağ bakış açısı kazanmak, terapötik müdahale için daha uygun olan hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. Yüksek verim tarama (HTS), 9-12, bu sorunları gidermek için ideal bir yöntem. ancak geleneksel yöntemlerle simpli kullanılan tek boyutlu tüm iyi hücre deneyleri,STIC karmaşık biyolojik süreçler için readouts. Onlar gibi, morfoloji özellikleri, 13, 14 aksonal ulaşım açıkları veya değişiklikler gibi nörodejeneratif hastalıklarda görülen birçok fenotipleri aynı anda ölçmek için koyamadık . Bu yaklaşım, bir hücre alt grubunda meydana gelen hücresel süreçleri ya da patojenik olayları dinamik doğasını araştırmak için kullanılan olamazdı. Bir çok-boyutlu fenotipleri geçmek için bu tür özellikleri ölçmek için yüksek içerik tarama (HCS) 4, 15-17 olarak nitelendirdi. HCS HTS göre çeşitli tedirginlikler hücresel yanıt daha ayrıntılı bir gösterimini sağlar, aynı anda çeşitli süreçlerin hücre tabanlı nicelikleme. HCS HTS 18, 19 üzerinden pek çok avantajı vardır, ancak nöronal modelleri, yüksek verimli (HT) yüksek içerik (HC) ekran yapmak, yüksek maliyet, çevresel değişim ve insan hatası nedeniyle sorunludur. &#39;Phenomics ölçekte hücresel tepkileri tespit etmek içinHC görüntüleme birini kullanarak, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik artırırken, değişim ve hatayı azaltmak için vardır. Bu yazıda shRNA ekranlarında nöronal hücre modellerinde otomatik Hücre kültü 20 ve HC görüntüleme kullanarak doğru ve güvenilir yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz biz mutasyona uğramış otozomal resesif parkinsonizm 21 neden belirli bir protein, DJ1, modülatörler tanımlamak için bu metodoloji nasıl kullanıldığını açıklar. HC görüntüleme HT yöntemleri ile çok yönlülüğünü birleştiren doğru bir bolluk fenotipleri ölçmek için mümkündür. Bu sonradan genomu anlayışımıza, hastalığın patogenezinde yer yolların yanı sıra potansiyel terapötik hedefler belirlemek ilerlemek için yararlanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about High Content Screening in Neurodegenerative Diseases at JoVE.com

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.

Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

high-content-screening-in-neurodegenerative-diseases

Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K Görüntüleme.  VU University Medical Center. Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.

Video: High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Tıp

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Nörodejeneratif Hastalıkların Analizi Difüzyon Tensör Manyetik Rezonans Görüntüleme

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.