Este trabajo fue financiado por el Centro de Tecnología de Comunicación Neural (CNCT), un Centro de Recursos P41 financiado por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas (NIBIB, P41 EB002030) y apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

1. Preparar Fijador (Ver tabla de fijador y tampones.) 2. Preparar los búferes de perfusión (Ver tabla de fijador y tampones.) 3. Preparar Aparatos y Anestesia <ol><li> Usando el baño de agua, tampón de perfusión caliente a 37 ° C. Colocar la válvula de salida en un vaso lleno con tampón. Llenar una jeringa de 50 ml con tampón y se conecte a un tubo fijador. Lave la tubería en varias ocasiones por la expulsión y retirada del tampón. </li><li> Borrar la línea con el tampón hasta que todas las burbujas de aire en la tubería se eliminan. Es crucial para el éxito de una perfusión no tener burbujas de aire en cualquiera de las líneas. </li><li> Retirar la jeringa y conectar el fijador de paraformaldehído al 4% (temperatura ambiente) el contenedor. Para evitar burbujas de aire en el extremo del tubo, apretar el tubo, mientras que la colocación del tubo en el recipiente de manera que una gota de tampón sobresale desde el extremo to ponerse en contacto con la superficie del fluido dentro del contenedor. </li><li> Cierre la puerta de salida (extremo de la aguja). Gire la válvula de amortiguación (azul) a la misma posición que la válvula de fijador (blanco). Esto permitirá que el flujo desde la línea de tampón solo. </li><li> Abra la puerta de salida y repita el paso A1 a A3 para el llenado de la línea de amortiguación. Después de que todas las burbujas de aire se eliminan cerrar el orificio de salida, retire la jeringa y conectar el recipiente tampón, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la tubería. </li><li> Sistema de prueba para la capacidad de mantener la presión de bombeo del blub manómetro de goma. Normalmente existe una cierta resistencia debido a la compresión de aire en el sistema. </li><li> Instalación de herramientas de la cirugía con el fin de de fácil acceso. Llenar aguja de perfusión con tampón para eliminar la posibilidad de burbujas de aire. </li><li> Antes de la cirugía, una mezcla de ketamina / xilazina (hasta 80 mg / kg de peso corporal y ketamina 10 mg / kg de peso corporal xilazina) se administra mediante inyección intraperitoneal (27 aguja de calibre y jeringa de 1 cc). La administración adicional de anestésico se llevará a cabo según sea necesario durante el curso de cada operación para mantener un plano quirúrgico de anestesia. </li></ol> 4. Perfusión Cirugía <ol><li> Una vez que el animal ha llegado a un plano quirúrgico de anestesia, colóquelo en la bandeja poco profunda llena de hielo picado. (Use dedo pizca de respuesta el método para determinar la profundidad de la anestesia. Animal debe ser que no responde antes de continuar). </li><li> Haga una incisión 5-6 cm lateral a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Con cuidado, separar el hígado a partir del diafragma. </li><li> Haga una pequeña incisión en la membrana con las tijeras curvas, romas. La posición y la presión del dedo puede ayudar en la capacidad de cortar el diafragma. </li><li> Continuar la incisión diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. </li><li> Coloque las tijeras curvas, romas a un lado de las costillas, el desplazamiento de cuidado de los pulmones, y hacer un cuT a través de la caja torácica hasta la clavícula. Haga un corte similar en el lado contralateral. </li><li> Elevación del esternón de distancia, recortar cuidadosamente cualquier tejido que lo conecta con el corazón. Sujetar la punta del esternón con la pinza hemostática y colocar la pinza hemostática sobre la cabeza. Cuando se hace correctamente, el timo se levanta desde el corazón, junto con el esternón, que proporciona una visión clara de los grandes vasos. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo con unas tijeras iris. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol start="8"><li> Pasar una aguja de calibre 15-perfusión romo o de oliva con punta-a través del ventrículo corte en la aorta ascendente. La punta debe ser visible a través de la pared de la aorta, y no debe llegar al arco de la aorta en las arterias braquial y carotídeo divergen. </li><li> Utilizar una pinza hemostática para sujetar el corazón, esto asegura la aguja y evita la fuga. Si se desea, el hemostato modificado puede ser utilizado para sujetar la aorta alrededor de la punta de la aguja (estas hemostatos permanecer en su lugar hasta que comienza la disección, pero se omiten las ilustraciones futuras para mayor claridad). </li><li> Por último, hacer una incisión a la aurícula derecha del animal con unas tijeras iris para crear una toma de corriente tan grande como sea posible sin dañar la aorta descendente. En este punto el animal está listo para ser perfundido. </li></ol> 5. Perfusión <ol><li> Abrir y conectar el puerto de salida a la aguja de la base con cuidado de no introducir burbujas de aire. </li><li> Sube el manómetro de la bombilla a una presión de 80 mm Hg con rapidez y de manera uniforme. Mantener esta presión durante todo el período de infusión de amortiguamiento. Inicie el temporizador. </li><li> Ajuste el ángulo de la aguja. El ángulo de la aguja es crítica para la consecución de una tasa máxima de flujo (observar el cambio de flujo con ajuste del ángulo). </li><li> Cambie el beneficioER válvula (azul) una vez tampón está casi terminado (200 ml). El líquido debe estar en ejecución claro. La limpieza del hígado es un indicador de una buena perfusión. El hígado debe ser clara en este punto. Indique el tiempo para sus registros. </li><li> Temblores de fijación deben ser observadas en cuestión de segundos, lo que debería ser considerado como el verdadero tiempo de la fijación. Indique el tiempo para sus registros. </li><li> La presión puede ser gradualmente aumentar hasta un máximo de 130 mm de Hg 2 para mantener un caudal constante. </li><li> Cierre la válvula de salida una vez que el fijador está casi terminado. Indique que termina el tiempo para sus registros. </li><li> La rata debe ser rígida en esta etapa. </li><li> El paraformaldehído se ha de recoger y almacenar para su eliminación de acuerdo a los reglamentos de su institución. </li></ol> 6. Disección de 4,11 <ol><li> Retire el cabezal con un par de tijeras. </li><li> Hacer una incisión a lo largo del tegumento desde el cuello hasta la nariz y exponer lacráneo. </li><li> Se quita el músculo del cuello que queda para que la base del cráneo está expuesto; eliminar cualquier muscular residual con tijera o gubias. </li><li> Coloque el extremo afilado de un par de tijeras iris en el agujero magno en un lado, cuidadosamente deslizando las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo. </li><li> A continuación, hacer un corte que se extiende hasta el borde distal de la superficie del cráneo posterior. Haga un corte idéntico en el lado contralateral. Utilice las gubias para despejar el cráneo por el cerebelo. </li><li> Deslice cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo como la punta se desplaza desde la esquina posterior dorsal distal al borde distal frontal del cráneo, levantando la hoja a medida que se corte para evitar daños en el cerebro. Repita para el lado opuesto. </li><li> Usando pinzas para pelar la superficie dorsal de la cabeza fuera del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando pinzas también. </li><li> Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosociones a lo largo de la superficie ventral del cerebro. </li><li> Suavemente se burlan de el cerebro lejos de la cabeza, el recorte de cualquier duración que aún conecta el cerebro con el cráneo con unas tijeras iris. </li><li> Quitar el cerebro y lo coloca en un vial de fijador líquido que contiene por lo menos 10 veces el volumen del cerebro mismo. Agitar el vial de vez en cuando. </li></ol> 7. Posterior a la fijación y almacenamiento <ol><li> Mantener el cerebro en fijador durante 24 horas a 4 ° C, agitando de vez en cuando. </li><li> Después de 24 horas, lave el cerebro con tampón fosfato salino mediante el intercambio de los medios de comunicación 3 veces y girando cada vez. </li><li> Los cerebros se pueden almacenar en tampón fosfato salino o HBHS con azida de sodio y se mantuvo a 4 ° C. </li></ol> 8. Los resultados representativos Un primer indicador del éxito de la perfusión es la limpieza de las extremidades, tales como la nariz, orejas y patas y los órganos internos tales como la glándula del timo y el hígado (IHC Mundial).Inspección macroscópica del cerebro revela el vacío vaso sanguíneo de la sangre (de color blanco a la apariencia de color amarillo pálido). Esto será cierto también en secciones de tejido destinar para la tinción e inmunohistoquímica. El indicador final de los resultados de la perfusión es la condición de la ultraestructura en el tejido. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparar Fijador: </td></tr><tr><td> Preparar un 8% de valores paraformaldehído </td></tr><tr><td><ol><li> Añadir 40 g de paraformaldehído y 500 ml de dH 2 O. Calentar la solución a 60 - 65 ° C mientras se agita (no superar los 65 ° C, ello puede afectar negativamente el éxito del procedimiento de inmunohistoquímica). </li><li> Para borrar la solución, reduzca el fuego y agregue 3.2 ml de NaOH 1,0 M con un gotero. </li><li> Filtrar y guardar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar 0,2 M tampón fosfato de sodio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Para el fosfato de sodio monobásico de archivo, añadir 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O a 1 L dH 2 O. </li><li> Para el fosfato sódico dibásico de stock, añadir 28,4 g de Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Añadir 810 ml de la población monobásico a 190 ml de la población dibásico. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar un 4% paraformaldehído fijador </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Agregar a partes iguales el 8% de acciones de paraformaldehído buffer fosfato de sodio 0,2 M </li><li> Nota: esta revisión está mejor preparado fresco, no más de 72 horas de antelación. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar la perfusión y tampones de almacenamiento: </td></tr><tr><td> Preparar tampón fosfato salino pH, 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L DH 2 O </li><li> 9 g de NaCl </li><li> 144 mg de KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg de Na 2 HPO 4 </li><li> Verificar el pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES buffer Hanks solución (HBHS) con un pH de 7,4 Azida sódica </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml de H2O </li><li> 7,5 g de NaCl, </li><li> 0,3 g de KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g de dextrosa / glucosa </li><li> 2.4 g 10 mm Hepes </li><li> 0,1 g de MgCl 2 6 partes de dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO4 7 partes dH 2 O </li><li> 0,165 g de CaCl2 2 partes DH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> Verificar el pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Preparación del fijador y tampones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; aparato de perfusión con componentes etiquetados. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparación de la perfusión Aparato I. Comienza con la línea de fijador. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón en la jeringa ya través de la línea. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja fuera. Coloque la línea de fijador en la botella de fijador sin introducir burbujas de aire. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparación de la perfusión Aparato II. 1. Abrir la válvula en el extremo de la aguja. 2. Gire la válvula de amortiguación (azul) en la posición de flujo. 3. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón con la jeringa. 4. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja. Coloque el tubo en la botella de amortiguación. Presión de prueba para asegurarse de que el sistema está sellado correctomente por el bombeo de la bombilla manómetro y observa el manómetro. El aparato está ahora listo para el procedimiento de perfusión. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Aparato de perfusión en la posición para la entrega de amortiguación. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusión Cirugía I. a) Haga una incisión lateral a través del tegumento y la pared abdominal. b) Hacer una incisión en el diafragma y cortar a través del diafragma exponer el corazón. Hacer cortes paralelos a cada lado de las costillas hasta la clavícula. c) sujetar la punta del esternón con la pinza hemostática y colocar la pinza hemostática sobre la cabeza. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusión Cirugía II. a) Se pasa la aguja de perfusión a través del ventrículo corte en la aorta ascendente. b) Fijar ella aguja de perfusión uso de un conjunto de pinzas hemostáticas para poner freno al corazón. Un segundo conjunto de una pinza hemostática modificada también se puede utilizar para sujetar la aorta alrededor de la punta de la aguja para evita la fuga. Con unas tijeras iris hará una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusión con bomba en el búfer de la bombilla de manómetro para crear presión en la línea. Abra la válvula (1) y conectar a la base de la aguja. Es fundamental asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido. Sube el bulbo manómetro a una presión de 80 mm Hg y mantener esta presión durante todo el período de infusión tampón. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. De perfusión con tampón de Fijación vez está casi terminado (200 ml) conmutar la válvula de tampón (1) para permitir la fijación al flujo. La presión se puede aumentar gradualmente hasta unmáximo de 130 mm de Hg. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> I. En la figura 9. La disección a) quitar de la cabeza con un par de tijeras. b) hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media desde el cuello hasta la nariz y exponer el cráneo. c) cortar el músculo del cuello restante de modo que la base del cráneo está expuesto. Sostenga la cabeza de modo que la gran abertura en la superficie del cráneo (foramen magnum) es accesible. Con cuidado, inserte la punta de unas tijeras iris en el foramen magnum y haga un corte. Repita la misma maniobra en el lado contralateral. Utilice las gubias para despejar el cráneo por el cerebelo. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Disección II. a) deslice cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo. Levante la punta a medida que se corte para evitar daños en el cerebro. Repita el mismo paralado opuesto. Utilizar gubias pelar el cráneo fuera del cerebro. b) ilustración con el cráneo removido y expuesto el cerebro. c) utilizar una espátula para cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas en la zona más anterior del cerebro. Guíe con cuidado la punta de la espátula a lo largo de la parte inferior del cerebro para separar las conexiones para facilitar su eliminación. Retire el cerebro y lo coloca en un vial de fijador.

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Notas adicionales para una operación exitosa: <ol><li> Una vez que el diafragma se rompe, precede rápidamente a medida que la hipoxia y la hipercapnia iniciará irreversibles los cambios fisiológicos que pueden confundir el análisis posterior. </li><li> Cuando se inserta la aguja y se sujeta en su lugar, la presión residual empujar la sangre a la base de la aguja (flashback). De hecho, los animales más grandes con fuerza puede expulsar sangre. Es crítico que la sangre por lo menos llegar a la base de la aguja para evitar la introducción de burbujas de aire que se presentan un obstáculo para completar la perfusión. Si no se observa sangre en la base de la aguja, retire la aguja y vuelva a llenar con el tampón de su anexión al puerto de salida de la torre de la perfusión. Una vez búfer se ha ejecutado a través de la punta de la aguja puede ser reinsertada en el corazón. </li><li> La colocación correcta de la aguja dentro de la aorta es crítico, no debe llegar tan lejos como el arco aórtico. </li><li> Si perfusiones múltiples están llevando a cabo no es necesario to la instalación desde el principio cada vez. El usuario debe tener el volumen adecuado, tanto para el buffer y fijador en cada botella (200 ml animal / solución). Las botellas también se puede rellenar si es necesario. El aspecto más importante a considerar es el lavado de la línea de perfusión que va desde la configuración para el animal (la válvula de salida). Después de la terminación de una perfusión, esta línea tendrá paraformaldehído al 4% en el mismo. Retirar el tubo de la botella de tampón y utilizar una jeringa de 50 ml lleno de agua para enjuagar el fijador. Asegúrese de que la válvula de salida se coloca en un vaso de recogida de residuos para su eliminación adecuada de la paraformaldehído. Repita esto tres veces. Rellene con buffer usando el mismo método que se muestra en la 2.3. </li><li> Este método para la fijación es altamente adaptable con la capacidad de cambiar tanto tampón y fijadores otros fijadores (tales como los utilizados para EM) de acuerdo con los requisitos del experimento. </li><li> El sistema también se utiliza frecuentemente para la extracción de tejido vivo. Por estaun proceso simplemente utiliza la entrega de tampón solo (la botella de tampón, mientras que todavía unido a todo el sistema se coloca en un cubo de hielo y la botella fijador esté preparada como vacío pero sellado). Esto asegura una perfusión tampón frío a la presión óptima. Desde aquí, el sistema puede ser adaptado a la infusión de colorantes fixable por cualquiera de añadir el colorante directamente a la memoria intermedia (si la cantidad no es un problema) o utilizar una jeringa con una cantidad mínima de tampón / solución de colorante en el tampón de entre - paso fijador. </li><li> En el caso de colada vascular, la monitorización de la presión paso tampón es crucial sin embargo debido a la viscosidad y solidificando la naturaleza de la solución de colada o bien una jeringa 50ml debe ser utilizado para la entrega directa o un accesorio desechable secundaria al aparato (tubos, válvulas y manteniendo contenedor) hecho a la interfaz con el sistema actual se utilizará. Nuestros laboratorios de fundición vascular precedió al diseño y fabricación del aparato de perfusión. Por lo tanto no podemos ST al hacerlecomió que las mediciones de la presión será una medición exacta en el sitio de entrega. Los números pueden tener que ser ajustados para conseguir un suministro exitoso de fluidos viscosos. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestésico: </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina mezcla (Anestesia pueden variar según el laboratorio / institución) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml frasco </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cirugía: </td></tr><tr><td> Punta de la aguja, 27 x 1,25 GA &quot; </td><td> Servicios de material </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes romas / romas tijeras curvas (aproximadamente 14,5 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Recta tijeras iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Norma pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Par de fino (Graefe) pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinza hemostática grandes - curvas o rectas (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 pinzas de hemostato estándar - recta dentada (14 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> Una pinza hemostática modificada (con orificio de calibre 15 presentada por la punta) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-calibre de la aguja con punta roma o de oliva-(aguja de perfusión) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusión: </td></tr><tr><td> HyPerfusion sistema o equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tamponada con fosfato salino pH, 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De vidrio poco profundo o una bandeja de plástico, de aproximadamente 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hielo picado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baño de agua (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temporizador </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml de jeringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> La disección: </td></tr><tr><td> Pensilvaniair de la norma tijeras rectas, rectas / romas (~ 12 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medio gubias curvas o rectas (14-16 cm) o pinzas de hueso del cráneo de eliminación </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Recta tijeras iris (~ 9 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-espátula (2 dobles &quot;extremos planos, uno redondeado, cónico uno a 1/8&quot;) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Posterior a la fijación y el almacenamiento: </td></tr><tr><td> 50 ml frasco de vidrio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml de HEPES-Buffered Hanks Solución (HBHS) con azida de sodio (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

El objetivo de la fijación es preservar rápida y uniformemente tejido en un estado de vida similar. Mientras que la colocación de tejido directamente en obras fijador bien para pequeños trozos de tejido, los especímenes más grandes como el cerebro intacto plantean un problema para la fijación de inmersión porque el fijador no llega a todas las regiones del tejido a la misma velocidad 5,7. A menudo, los cambios en respuesta a la hipoxia comenzar antes de que el tejido se puede conservar 12. La ventaja de la fijación directa perfusión a través del sistema circulatorio es que el producto químico puede llegar rápidamente a todos los rincones del organismo a través de la red vascular natural. A fin de utilizar el sistema circulatorio más eficaz, se debe tener cuidado para que coincida con presiones fisiológicas 3. Es importante señalar que las presiones fisiológicas son dependientes de la especie utilizada. Las técnicas para la fijación de perfusión varían en función del tejido a ser fijado y cómo el tejido será procesado posterior a la fijación. En este vídeo, Se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro para inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica (vs alimentada por gravedad sistemas) es que el sistema circulatorio se utiliza más eficazmente.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.

Animal entero fijación por perfusión de los roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.3K vistas.  University of Michigan. Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.

Video: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reproducción automática de vídeo interactivo de Estudios de la Comunicación Animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Investigación

Neurociencias

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

Una instalación de Bajo Costo para audiometría conductual en roedores

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Técnica de fijación en el acrílico resina de moldeo basado en Jefe en roedores

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...