Diese Arbeit wurde vom Center for Neural Kommunikationstechnologie (CNCT), eine P41 Resource Center des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) gefördert und unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) finanziert.

1. Bereiten Sie Fixativ (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 2. Bereiten Perfusion Puffer (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 3. Bereiten Apparate-und Anästhesie <ol><li> Mit dem Wasserbad warm Perfusionspuffer bis 37 ° C. Auslaßventil Platz in einem Becherglas mit Puffer gefüllt. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Puffer und heften sich an Fixativ Schlauch. Flush Schlauch wiederholt durch Austreiben und Aberkennung der Puffer. </li><li> Deaktivieren der Linie mit Puffer, bis alle Luftblasen in dem Schlauch entfernt sind. Es ist entscheidend für den Erfolg eines Perfusion um keine Luftblasen zu einem der Linien haben. </li><li> Entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die 4% Paraformaldehyd-Fixativ (Raumtemperatur) Behälter. Um Luftblasen am Rohrende zu vermeiden, drücken das Rohr während der Positionierung des Rohrs in den Behälter, so dass ein Tropfen Puffer von dem Ende to an der Oberfläche der Flüssigkeit in dem Behälter. </li><li> Schließen der Auslaßöffnung (Nadelende). Drehen Puffer Ventil (blau) auf der gleichen Position wie das Fixiermittel Ventil (weiß). Dies ermöglicht Flow aus dem Puffer Linie nur. </li><li> Öffnen Sie die Auslassöffnung und wiederholen Sie Schritt A1 bis A3 zum Füllen des Puffers Linie. Nachdem alle Luftblasen nahe der Auslassöffnung eliminiert werden, entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Pufferbehälter, dabei nicht um Luftblasen in den Schlauch einführen. </li><li> Testsystem zur Fähigkeit, Druck durch Pumpen mit der Gummi-Manometer blub halten. Es ist normalerweise ein Widerstand durch die Kompression der Luft in dem System. </li><li> Richten Chirurgie Werkzeuge, damit leicht zugänglich. Füllen Perfusion Nadel mit Puffer, um die Möglichkeit von Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Vor der Operation wird ein Ketamin / Xylazin-Mischung (bis zu 80 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 Gauge Nadel und 1 ml-Spritze) verabreicht. Zusätzliche der Anästhesie falls erforderlich, wird im Verlauf jeder Operation, um ein chirurgisches Ebene Anästhesie beizubehalten durchgeführt werden. </li></ol> 4. Perfusion Chirurgie <ol><li> Sobald das Tier einen chirurgischen Ebene der Anästhesie erreicht hat, setzt sie auf die flache Schale mit Crushed Ice gefüllt. (Verwenden Sie Zeh Pinch-Response-Verfahren, um Narkosetiefe zu bestimmen. Tier darf nicht ansprechbar sein, bevor Sie fortfahren). </li><li> Machen Sie eine 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Sie vorsichtig die Leber von der Membran. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit den gebogenen, stumpfen Schere. Die Position und der Druck des dem Finger in der Fähigkeit, um die Membran geschnitten zu unterstützen. </li><li> Fahren Sie mit der Membran Einschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle aussetzen. </li><li> Legen gebogen, stumpf Scheren entlang einer Seite der Rippen, sorgfältig Verschieben der Lunge, und einen cut durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite. </li><li> Heben Sie das Brustbein entfernt, schneiden Sie aufmerksam alle Gewebe Anschluss an das Herz. Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. Wenn man es richtig macht, hebt die Thymusdrüse entfernt vom Herzen zusammen mit dem Brustbein und bietet einen freien Blick auf den großen Schiffen. </li><li> Einen kleinen Schnitt mit dem hinteren Ende des linken Ventrikels mit Iris Schere. </li></ol><img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol start="8"><li> Übergeben Sie eine 15-Gauge-stumpf-oder Olivenöl-bestückte Perfusion Nadel durch den Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. Die Spitze sichtbar sein soll durch die Wand der Aorta, und sollte nicht erreichen den Aortenbogen, wo die Arm-und Halsschlagadern divergieren. </li><li> Mit einer Klemme, um das Herz zu klemmen, sichert dies die Nadel und ein Auslaufen verhindert. Falls gewünscht, kann das modifizierte Gefäßklemme verwendet, um die Aorta um die Nadelspitze Klemme (diese Hämostaten werden bis zum Dissektion beginnt, wird aber von künftigen Abbildungen aus Gründen der Klarheit weggelassen werden). </li><li> Schließlich einen Einschnitt machen, um das Tier rechten Vorhof mit Iris-Schere, um so groß wie möglich einen Ausgang ohne Beschädigung der absteigenden Aorta zu schaffen. An diesem Punkt ist das Tier bereit, perfundiert werden. </li></ol> 5. Perfusion <ol><li> Öffnen und schließen Auslassöffnung zu Nadelgrundteils kümmert sich nicht um mögliche Luftblasen einzuführen. </li><li> Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg schnell &amp; gleichmäßig. Halten Sie diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. Starten Sie den Timer. </li><li> Passen Sie die Nadel Winkel. Der Winkel der Nadel ist entscheidend für die Erreichung eines maximalen Durchfluss (man beachte die Strömung Veränderung mit Winkelverstellung). </li><li> Schalten Sie den Buffer Ventil (blau), wenn Puffer ist fast fertig (200 ml). Die Flüssigkeit sollte ausgeführt werden, klar. Die Räumung der Leber ist ein Indikator für eine gute Durchblutung. Die Leber sollte an dieser Stelle klar. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Fixation Zittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden, dies sollte in Betracht gezogen der wahre Zeitpunkt der Fixierung werden. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Der Druck kann schrittweise auf bis zu einem Maximum von 130 mm Hg 2, um eine konstante Durchflussrate zu halten. </li><li> Schließen Sie das Auslassventil einmal das Fixativ fast fertig ist. Geben Sie die Endzeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Die Ratte sollte in dieser Phase steif. </li><li> Das verwendete Paraformaldehyd müssen gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden gemäß den Vorschriften Ihrer Institution. </li></ol> 6. Dissection 4,11 <ol><li> Nehmen Sie den Kopf mit einer Schere. </li><li> Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang der Haut vom Hals bis zur Nase und setzen dieSchädel. </li><li> Schneiden Sie die verbleibenden Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels freigelegt wird; entfernen Restmuskelfunktionen mit Schere oder Rongeure. </li><li> Platzieren Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, sorgfältig Verschieben der Schere entlang der Innenfläche des Schädels. </li><li> Als nächstes erstellen Sie ein Schnitt Verlängerung bis zum äußeren Rand des hinteren Schädel Oberfläche. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. </li><li> Vorsichtig die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels, während die Spitze bewegt sich von der dorsalen distalen hinteren Ecke des distalen Vorderkante des Schädels, Anheben der Schaufel, wie Sie schneiden, um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern. Der gegenüberliegenden Seite wiederholen. </li><li> Mit Rongeure peel der dorsalen Oberfläche des Schädels entfernt vom Gehirn. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit Rongeure ebenso. </li><li> Mit einem Spatel, trennen Sie die Riechkolben und nervöse Verbindunggen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns. </li><li> Sie vorsichtig in das Gehirn vom Kopf weg, Trimmen jedes Dura noch verbindet das Gehirn mit dem Schädel mittels Blende Schere. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem Fläschchen von Fixativ haltigen Flüssigkeit mindestens 10x das Volumen des Gehirns selber. Schwenken Sie die Durchstechflasche gelegentlich. </li></ol> 7. Post-Fixierung und Lagerung <ol><li> Halten Sie das Gehirn in Fixierungsmittel für 24 Stunden bei 4 ° C, gelegentlich wirbeln. </li><li> Nach 24 Stunden Waschen des Gehirns mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung durch den Austausch der Medien 3 Mal und Verwirbelung jeweils. </li><li> Gehirne können dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung aufbewahrt werden oder HBHS mit Natriumazid und bei 4 ° C </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein erster Indikator für den Erfolg der Perfusion ist die Rodung von Extremitäten wie Nase, Ohren und Pfoten und innere Organe wie der Thymusdrüse und der Leber (IHC World).Gross Inspektion des Gehirns zeigt das Blutgefäß Leere des Blutes (weiße bis hellgelbe Aussehen). Das wird auch in Gewebeschnitten Destine für die Färbung und Immunhistochemie wahr. Der letzte Indikator des Ergebnisses der Perfusion ist der Zustand der Ultrastruktur im Gewebe. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Bereiten Sie Fixativ: </td></tr><tr><td> Bereiten 8% Paraformaldehyd Lager </td></tr><tr><td><ol><li> Fügen Sie 40 g Paraformaldehyd in 500 ml dH 2 O. Erhitzen Sie die Lösung auf 60 - 65 ° C unter Rühren (nicht mehr als 65 ° C, dabei kann sich negativ auf den Erfolg der immunhistochemischen Verfahren). </li><li> Um die Lösung klar, Hitze reduzieren und 2-3 ml von 1,0 M NaOH mit einer Pipette. </li><li> Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li></ol></td></tr><tr><td> Planen 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Für die Mononatriumphosphat Lager, fügen 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O auf 1 L dH 2 O. </li><li> Für die Dinatriumhydrogenphosphat Lager, hinzuzufügen 28,4 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O </li><li> Fügen Sie 810 ml des einbasischen Lager bis 190 ml des zweibasischen Lager. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd-Fixativ </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> In gleichen Teilen 8% Paraformaldehyd Lager zu 0,2 M Natriumphosphat-Puffer </li><li> Hinweis: dieses Update wird am besten frisch zubereitet, nicht mehr als 72 Stunden im Voraus. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Perfusion und Lagerung Puffer: </td></tr><tr><td> Bereiten Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 l dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES-gepufferter Hanks Solution (HBHS) mit Natriumazid pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7,5 g NaCl, </li><li> 0,3 g KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Dextrose / Glucose </li><li> 2,4 g 10 mM Hepes </li><li> 0,1 g MgCl 2 6 Teile dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 Teile dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 Teile dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vorbereitung der Fixierlösung und Puffer. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Abbildung 1. </strong&gt; Perfusionsapparatur mit markierten Komponenten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vorbereitung des Perfusionsapparatur I. mit dem Fixativ Zeile beginnen. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer in die Spritze und durch die Leitung. Schließen Sie das Ventil auf der Nadel Ende aus. Legen Sie die Leitung in den Fixativ Fixativ Flasche ohne Einbringen von Luftblasen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 3. Herstellung der Vorrichtung Perfusion II. 1. Ventil öffnen auf dem Nadelende. 2. Schalten Puffer Ventil (blau) bis zum Fluss zu positionieren. 3. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer mit der Spritze. 4. Ventil schließen auf dem Nadelende. Setzen Sie das Rohr in die Flasche Puffer. Prüfdruck um sicherzustellen, dass das System versiegelt ist richtigly durch das Aufpumpen des Manometer Glühbirne und beobachtete die Spurweite. Die Vorrichtung ist jetzt bereit für die Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 4. Perfusion Vorrichtung in Position für den Puffer Lieferung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Abbildung 5. Perfusion Chirurgie I. a) Machen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchwand. b) Einen Einschnitt in der Membran geschnitten und an der Membran Aussetzen des Herzens. Machen parallele Schnitte auf beiden Seiten der Rippen bis zum Schlüsselbein. c) klemmen die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Abbildung 6. Perfusion Chirurgie II. a) Führen Sie die Nadel durch die Perfusion Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. b) Sichern Sie diePerfusion Nadel Verwendung eines Satzes von Hämostaten, um das Herz zu klemmen. Ein zweiter Satz von einem modifizierten Gefäßklemme kann auch verwendet werden, um die Aorta um die Nadelspitze um ein Auslaufen verhindert festzuklemmen. Mit Iris Schere einen kleinen Einschnitt zu dem hinteren Ende des linken Ventrikels. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Abbildung 7. Perfusion mit Pufferpumpe das Manometer Glühbirne zu Druck in der Leitung zu schaffen. Öffnen Sie das Ventil (1) und heften sich an der Nadel-Hub. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg und pflegen diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Abbildung 8. Perfusion mit Fixativ Sobald Puffer ist fast fertig (200 ml) schalten Sie den Puffer Ventil (1), um für das Fixativ fließen zu lassen. Der Druck kann allmählich bis zu einem erhöht werdenmaximal 130 mm Hg beträgt. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Abbildung 9. Dissection I. a) entfernen Sie den Kopf mit einem Paar Scheren. b) Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase und setzen den Schädel. c) schneiden Sie die restlichen Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels ausgesetzt ist. Halten Sie den Kopf, so dass die große Öffnung in der Schädeldecke Oberfläche (Foramen magnum) zugänglich ist. Schieben Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum und machen einen Schnitt. Wiederholen Sie das gleiche Manöver für die Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Abbildung 10. Dissection II. a) Schieben Sie die Schere entlang der Innenfläche des Schädels. Heben Sie an der Spitze, wie Sie schneiden, um Schäden am Gehirn zu verhindern. Wiederholen Sie das gleiche fürgegenüberliegenden Seite. Verwenden Sie Rongeure schälen dem Schädel entfernt vom Gehirn. b) Illustration mit dem Schädel entfernt und das Gehirn ausgesetzt. c) Mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen an der vordersten Stelle des Gehirns zu trennen. Führen Sie das Spatelspitze entlang der Unterseite des Gehirns, um Verbindungen zu erleichtern entfernen zu trennen. Entfernen Sie das Gehirn und legen es in das Fläschchen mit Fixativ.

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zusätzliche Hinweise für eine erfolgreiche Operation: <ol><li> Sobald die Membran verletzt wird, vorausgehen schnell wie Hypoxie und Hyperkapnie wird irreversiblen physiologischen Veränderungen, die anschließende Analyse verfälschen können zu initiieren. </li><li> Wenn die Nadel eingeführt wird und eingespannt wird der Restdruck Blut der Basis der Nadel (Rückblende) zu drücken. In der Tat können größere Tiere zu vertreiben kräftig Blut. Es ist wichtig, dass Blut mindestens bis die Basis der Nadel zu vermeiden Einbringen von Luftblasen, die schädlich für Perfusion abzuschließen präsentieren. Wenn kein Blut an der Nadel Basis beobachtet wird, entfernen Sie die Nadel ab und füllen mit Puffer, indem Sie es mit der Auslassöffnung der Perfusion rig. Sobald Puffer hat durch die Spitze ausgeführt wurde, kann die Nadel in das Herz wieder eingesetzt werden. </li><li> Die richtige Platzierung der Nadel innerhalb der Aorta ist kritisch, sollte es nicht so weit wie der Aortenbogen erreichen. </li><li> Wenn mehrere Infusionen stattfinden ist es nicht notwendig to Einrichtung von Anfang an jedes Mal, wenn. Der Benutzer muss das richtige Volumen sowohl für den Puffer und Fixiermittel bei jeder Flasche (200 ml Tier / Lösung). Die Flaschen können auch wieder aufgefüllt, wenn nötig. Der wichtigste Aspekt ist Ausspülen der Perfusion Linie, die vom Setup für das Tier (Auslassventil) läuft. Nach dem Abschluss einer Perfusion, wird diese Zeile 4% Paraformaldehyd in ihm haben. Entfernen Sie den Schlauch von der Flasche Puffer und verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit Wasser gefüllt zu spülen, das Fixativ. Stellen Sie sicher, das Auslassventil in einem Becherglas Abfallsammlung für die ordnungsgemäße Entsorgung des Paraformaldehyd platziert wird. Wiederholen Sie dies dreimal. Refill mit Puffer mit der gleichen Methode in 2.3 dargestellt. </li><li> Dieses Verfahren zur Fixierung ist sehr anpassungsfähig mit der Fähigkeit, sowohl Puffer und Fixiermittel auch andere Fixierungsmittel (z. B. für EM verwendet) entsprechend den Anforderungen des Experiments zu ändern. </li><li> Das System wird auch häufig für die Extraktion von lebendem Gewebe verwendet. DazuVerfahren benutzt man einfach die Lieferung von Puffer nur (der Puffer Flasche, während immer noch auf ganze System angeschlossen ist in einem Eiskübel gestellt und das Fixativ Flasche ist leer, aber Setup als versiegelt). Dies gewährleistet eine kalte Perfusion Puffer an der optimalen Druck. Von hier aus kann das System zur Infusion von fixierbar Farbstoffe entweder durch Hinzufügen der Farbstoff direkt in den Zwischenspeicher (wenn die Menge kein Problem ist) oder eine Spritze mit einer minimalen Menge an Puffer / Farbstofflösung zwischen dem Puffer angepasst werden - Fixiermittel Schritt. </li><li> Bei vaskulären Gießen, ist die Drucküberwachung Puffer Schritt jedoch von entscheidender Bedeutung aufgrund der Viskosität und Verfestigen der Natur der Gießlösung entweder ein 50ml Spritze zur unmittelbaren Lieferung oder eine Einweg zweiten Befestigung der Vorrichtung verwendet werden (Schlauch, Ventil und hält Behälter) hat eine Schnittstelle mit dem aktuellen System verwendet werden. Unsere Labors &quot;vaskuläre Casting ging der Konstruktion und Fertigung des Perfusionsapparatur. Deshalb können wir nicht STgegessen, daß die Druckmessungen eine genaue Messung der Liefer-Site sein. Die Zahlen müssen eventuell angepasst, um eine erfolgreiche Bereitstellung von viskosen Flüssigkeiten zu erreichen. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Betäubungsmittel: </td></tr><tr><td> Ketamin / Xylazin-Mischung (Betäubungsmittel können je nach Labor / Institution variieren) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml Fläschchen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgie: </td></tr><tr><td> Nadelspitze, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Materiel Dienstleistungen </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Große stumpf / stumpf gebogenen Schere (~ 14,5 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Paar schöne (Graefe) Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 große Gefäßklemme Pinzette - gebogen oder gerade (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Standard Gefäßklemme Pinzette - gerade verzahnte (14 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 modifiziert Gefäßklemme (mit 15-Gauge-Loch durch die Spitze gestellt) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-Gauge-stumpf oder oliv-bestückte Nadel (Perfusion Nadel) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusion: </td></tr><tr><td> Hyperfusion System oder eine gleichwertige &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flache Schale aus Glas oder Kunststoff, ca. 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crushed Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Spritze </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair von Standard spitz / stumpf gerade Schere (~ 12 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Mittlere gebogen oder gerade Rongeure (14-16 cm) oder Schädelknochen Entfernung Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere (~ 9 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro-Spatel (Doppel 2 &quot;flachen Enden, ein abgerundet, abgeschrägt, um ein 1/8&quot;) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Postfixierung &amp; Lagerung: </td></tr><tr><td> 50 ml Glasfläschchen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES-gepufferte Hanks-Lösung (HBHS) mit Natriumazid (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

Das Ziel der Fixierung ist es, schnell und gleichmäßig zu bewahren Gewebe in einem lebensbedrohlichen Zustand. Während die Platzierung direkt im Gewebe Fixativ eignet sich gut für kleine Gewebestücke, größere Exemplare wie die intakten Gehirn ein Problem darstellen, zum Eintauchen Fixierung, weil das Fixativ nicht erreicht, alle Regionen des Gewebes mit der gleichen Rate 5,7. Oft fangen sich in Reaktion auf Hypoxie, bevor das Gewebe 12 erhalten werden kann. Der Vorteil der direkt Perfusion Fixativ durch das Kreislaufsystem ist, dass die chemische lassen sich schnell erreichen jeden Winkel des Organismus mit dem natürlichen Kreislauf-Netz. Um den Kreislauf am besten zu nutzen, muss darauf geachtet werden, anzeigen lassen physiologischen Drücken 3. Es ist wichtig zu beachten, dass die physiologische Drücke abhängig von der verwendeten Art sind. Techniken für Perfusionsfixierung hängen von der zu fixierenden Gewebe abhängig und wie das Gewebe wird folgende Fixierung verarbeitet werden. In diesem Video, Beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns für die Immunhistochemie zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik (vs Schwerkraft-Systeme) ist, dass die Kreislauf-System am effektivsten genutzt wird.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.3K Aufrufe.  University of Michigan. Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Serie: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

Ein Low-Cost-Setup für Verhaltensaudiometrie in Nagetiere

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Acrylharz-Form Based Leiter Fixationstechnik in Nagetiere

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...