Name: whole animal perfusion fixation for rodents
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Diese Arbeit wurde vom Center for Neural Kommunikationstechnologie (CNCT), eine P41 Resource Center des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) gefördert und unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) finanziert.

1. Bereiten Sie Fixativ (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 2. Bereiten Perfusion Puffer (Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.) 3. Bereiten Apparate-und Anästhesie <ol><li> Mit dem Wasserbad warm Perfusionspuffer bis 37 ° C. Auslaßventil Platz in einem Becherglas mit Puffer gefüllt. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Puffer und heften sich an Fixativ Schlauch. Flush Schlauch wiederholt durch Austreiben und Aberkennung der Puffer. </li><li> Deaktivieren der Linie mit Puffer, bis alle Luftblasen in dem Schlauch entfernt sind. Es ist entscheidend für den Erfolg eines Perfusion um keine Luftblasen zu einem der Linien haben. </li><li> Entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die 4% Paraformaldehyd-Fixativ (Raumtemperatur) Behälter. Um Luftblasen am Rohrende zu vermeiden, drücken das Rohr während der Positionierung des Rohrs in den Behälter, so dass ein Tropfen Puffer von dem Ende to an der Oberfläche der Flüssigkeit in dem Behälter. </li><li> Schließen der Auslaßöffnung (Nadelende). Drehen Puffer Ventil (blau) auf der gleichen Position wie das Fixiermittel Ventil (weiß). Dies ermöglicht Flow aus dem Puffer Linie nur. </li><li> Öffnen Sie die Auslassöffnung und wiederholen Sie Schritt A1 bis A3 zum Füllen des Puffers Linie. Nachdem alle Luftblasen nahe der Auslassöffnung eliminiert werden, entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Pufferbehälter, dabei nicht um Luftblasen in den Schlauch einführen. </li><li> Testsystem zur Fähigkeit, Druck durch Pumpen mit der Gummi-Manometer blub halten. Es ist normalerweise ein Widerstand durch die Kompression der Luft in dem System. </li><li> Richten Chirurgie Werkzeuge, damit leicht zugänglich. Füllen Perfusion Nadel mit Puffer, um die Möglichkeit von Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Vor der Operation wird ein Ketamin / Xylazin-Mischung (bis zu 80 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 Gauge Nadel und 1 ml-Spritze) verabreicht. Zusätzliche der Anästhesie falls erforderlich, wird im Verlauf jeder Operation, um ein chirurgisches Ebene Anästhesie beizubehalten durchgeführt werden. </li></ol> 4. Perfusion Chirurgie <ol><li> Sobald das Tier einen chirurgischen Ebene der Anästhesie erreicht hat, setzt sie auf die flache Schale mit Crushed Ice gefüllt. (Verwenden Sie Zeh Pinch-Response-Verfahren, um Narkosetiefe zu bestimmen. Tier darf nicht ansprechbar sein, bevor Sie fortfahren). </li><li> Machen Sie eine 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Sie vorsichtig die Leber von der Membran. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit den gebogenen, stumpfen Schere. Die Position und der Druck des dem Finger in der Fähigkeit, um die Membran geschnitten zu unterstützen. </li><li> Fahren Sie mit der Membran Einschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle aussetzen. </li><li> Legen gebogen, stumpf Scheren entlang einer Seite der Rippen, sorgfältig Verschieben der Lunge, und einen cut durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite. </li><li> Heben Sie das Brustbein entfernt, schneiden Sie aufmerksam alle Gewebe Anschluss an das Herz. Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. Wenn man es richtig macht, hebt die Thymusdrüse entfernt vom Herzen zusammen mit dem Brustbein und bietet einen freien Blick auf den großen Schiffen. </li><li> Einen kleinen Schnitt mit dem hinteren Ende des linken Ventrikels mit Iris Schere. </li></ol><img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol start="8"><li> Übergeben Sie eine 15-Gauge-stumpf-oder Olivenöl-bestückte Perfusion Nadel durch den Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. Die Spitze sichtbar sein soll durch die Wand der Aorta, und sollte nicht erreichen den Aortenbogen, wo die Arm-und Halsschlagadern divergieren. </li><li> Mit einer Klemme, um das Herz zu klemmen, sichert dies die Nadel und ein Auslaufen verhindert. Falls gewünscht, kann das modifizierte Gefäßklemme verwendet, um die Aorta um die Nadelspitze Klemme (diese Hämostaten werden bis zum Dissektion beginnt, wird aber von künftigen Abbildungen aus Gründen der Klarheit weggelassen werden). </li><li> Schließlich einen Einschnitt machen, um das Tier rechten Vorhof mit Iris-Schere, um so groß wie möglich einen Ausgang ohne Beschädigung der absteigenden Aorta zu schaffen. An diesem Punkt ist das Tier bereit, perfundiert werden. </li></ol> 5. Perfusion <ol><li> Öffnen und schließen Auslassöffnung zu Nadelgrundteils kümmert sich nicht um mögliche Luftblasen einzuführen. </li><li> Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg schnell &amp; gleichmäßig. Halten Sie diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. Starten Sie den Timer. </li><li> Passen Sie die Nadel Winkel. Der Winkel der Nadel ist entscheidend für die Erreichung eines maximalen Durchfluss (man beachte die Strömung Veränderung mit Winkelverstellung). </li><li> Schalten Sie den Buffer Ventil (blau), wenn Puffer ist fast fertig (200 ml). Die Flüssigkeit sollte ausgeführt werden, klar. Die Räumung der Leber ist ein Indikator für eine gute Durchblutung. Die Leber sollte an dieser Stelle klar. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Fixation Zittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden, dies sollte in Betracht gezogen der wahre Zeitpunkt der Fixierung werden. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Der Druck kann schrittweise auf bis zu einem Maximum von 130 mm Hg 2, um eine konstante Durchflussrate zu halten. </li><li> Schließen Sie das Auslassventil einmal das Fixativ fast fertig ist. Geben Sie die Endzeit für Ihre Unterlagen. </li><li> Die Ratte sollte in dieser Phase steif. </li><li> Das verwendete Paraformaldehyd müssen gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden gemäß den Vorschriften Ihrer Institution. </li></ol> 6. Dissection 4,11 <ol><li> Nehmen Sie den Kopf mit einer Schere. </li><li> Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang der Haut vom Hals bis zur Nase und setzen dieSchädel. </li><li> Schneiden Sie die verbleibenden Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels freigelegt wird; entfernen Restmuskelfunktionen mit Schere oder Rongeure. </li><li> Platzieren Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, sorgfältig Verschieben der Schere entlang der Innenfläche des Schädels. </li><li> Als nächstes erstellen Sie ein Schnitt Verlängerung bis zum äußeren Rand des hinteren Schädel Oberfläche. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. </li><li> Vorsichtig die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels, während die Spitze bewegt sich von der dorsalen distalen hinteren Ecke des distalen Vorderkante des Schädels, Anheben der Schaufel, wie Sie schneiden, um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern. Der gegenüberliegenden Seite wiederholen. </li><li> Mit Rongeure peel der dorsalen Oberfläche des Schädels entfernt vom Gehirn. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit Rongeure ebenso. </li><li> Mit einem Spatel, trennen Sie die Riechkolben und nervöse Verbindunggen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns. </li><li> Sie vorsichtig in das Gehirn vom Kopf weg, Trimmen jedes Dura noch verbindet das Gehirn mit dem Schädel mittels Blende Schere. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem Fläschchen von Fixativ haltigen Flüssigkeit mindestens 10x das Volumen des Gehirns selber. Schwenken Sie die Durchstechflasche gelegentlich. </li></ol> 7. Post-Fixierung und Lagerung <ol><li> Halten Sie das Gehirn in Fixierungsmittel für 24 Stunden bei 4 ° C, gelegentlich wirbeln. </li><li> Nach 24 Stunden Waschen des Gehirns mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung durch den Austausch der Medien 3 Mal und Verwirbelung jeweils. </li><li> Gehirne können dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung aufbewahrt werden oder HBHS mit Natriumazid und bei 4 ° C </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein erster Indikator für den Erfolg der Perfusion ist die Rodung von Extremitäten wie Nase, Ohren und Pfoten und innere Organe wie der Thymusdrüse und der Leber (IHC World).Gross Inspektion des Gehirns zeigt das Blutgefäß Leere des Blutes (weiße bis hellgelbe Aussehen). Das wird auch in Gewebeschnitten Destine für die Färbung und Immunhistochemie wahr. Der letzte Indikator des Ergebnisses der Perfusion ist der Zustand der Ultrastruktur im Gewebe. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Bereiten Sie Fixativ: </td></tr><tr><td> Bereiten 8% Paraformaldehyd Lager </td></tr><tr><td><ol><li> Fügen Sie 40 g Paraformaldehyd in 500 ml dH 2 O. Erhitzen Sie die Lösung auf 60 - 65 ° C unter Rühren (nicht mehr als 65 ° C, dabei kann sich negativ auf den Erfolg der immunhistochemischen Verfahren). </li><li> Um die Lösung klar, Hitze reduzieren und 2-3 ml von 1,0 M NaOH mit einer Pipette. </li><li> Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li></ol></td></tr><tr><td> Planen 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Für die Mononatriumphosphat Lager, fügen 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O auf 1 L dH 2 O. </li><li> Für die Dinatriumhydrogenphosphat Lager, hinzuzufügen 28,4 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O </li><li> Fügen Sie 810 ml des einbasischen Lager bis 190 ml des zweibasischen Lager. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd-Fixativ </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> In gleichen Teilen 8% Paraformaldehyd Lager zu 0,2 M Natriumphosphat-Puffer </li><li> Hinweis: dieses Update wird am besten frisch zubereitet, nicht mehr als 72 Stunden im Voraus. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereiten Perfusion und Lagerung Puffer: </td></tr><tr><td> Bereiten Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 l dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES-gepufferter Hanks Solution (HBHS) mit Natriumazid pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7,5 g NaCl, </li><li> 0,3 g KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Dextrose / Glucose </li><li> 2,4 g 10 mM Hepes </li><li> 0,1 g MgCl 2 6 Teile dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 Teile dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 Teile dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> PH-Wert prüfen </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vorbereitung der Fixierlösung und Puffer. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Abbildung 1. </strong&gt; Perfusionsapparatur mit markierten Komponenten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vorbereitung des Perfusionsapparatur I. mit dem Fixativ Zeile beginnen. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer in die Spritze und durch die Leitung. Schließen Sie das Ventil auf der Nadel Ende aus. Legen Sie die Leitung in den Fixativ Fixativ Flasche ohne Einbringen von Luftblasen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 3. Herstellung der Vorrichtung Perfusion II. 1. Ventil öffnen auf dem Nadelende. 2. Schalten Puffer Ventil (blau) bis zum Fluss zu positionieren. 3. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer mit der Spritze. 4. Ventil schließen auf dem Nadelende. Setzen Sie das Rohr in die Flasche Puffer. Prüfdruck um sicherzustellen, dass das System versiegelt ist richtigly durch das Aufpumpen des Manometer Glühbirne und beobachtete die Spurweite. Die Vorrichtung ist jetzt bereit für die Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 4. Perfusion Vorrichtung in Position für den Puffer Lieferung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Abbildung 5. Perfusion Chirurgie I. a) Machen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchwand. b) Einen Einschnitt in der Membran geschnitten und an der Membran Aussetzen des Herzens. Machen parallele Schnitte auf beiden Seiten der Rippen bis zum Schlüsselbein. c) klemmen die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Abbildung 6. Perfusion Chirurgie II. a) Führen Sie die Nadel durch die Perfusion Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. b) Sichern Sie diePerfusion Nadel Verwendung eines Satzes von Hämostaten, um das Herz zu klemmen. Ein zweiter Satz von einem modifizierten Gefäßklemme kann auch verwendet werden, um die Aorta um die Nadelspitze um ein Auslaufen verhindert festzuklemmen. Mit Iris Schere einen kleinen Einschnitt zu dem hinteren Ende des linken Ventrikels. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Abbildung 7. Perfusion mit Pufferpumpe das Manometer Glühbirne zu Druck in der Leitung zu schaffen. Öffnen Sie das Ventil (1) und heften sich an der Nadel-Hub. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg und pflegen diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Abbildung 8. Perfusion mit Fixativ Sobald Puffer ist fast fertig (200 ml) schalten Sie den Puffer Ventil (1), um für das Fixativ fließen zu lassen. Der Druck kann allmählich bis zu einem erhöht werdenmaximal 130 mm Hg beträgt. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Abbildung 9. Dissection I. a) entfernen Sie den Kopf mit einem Paar Scheren. b) Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase und setzen den Schädel. c) schneiden Sie die restlichen Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels ausgesetzt ist. Halten Sie den Kopf, so dass die große Öffnung in der Schädeldecke Oberfläche (Foramen magnum) zugänglich ist. Schieben Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum und machen einen Schnitt. Wiederholen Sie das gleiche Manöver für die Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Abbildung 10. Dissection II. a) Schieben Sie die Schere entlang der Innenfläche des Schädels. Heben Sie an der Spitze, wie Sie schneiden, um Schäden am Gehirn zu verhindern. Wiederholen Sie das gleiche fürgegenüberliegenden Seite. Verwenden Sie Rongeure schälen dem Schädel entfernt vom Gehirn. b) Illustration mit dem Schädel entfernt und das Gehirn ausgesetzt. c) Mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen an der vordersten Stelle des Gehirns zu trennen. Führen Sie das Spatelspitze entlang der Unterseite des Gehirns, um Verbindungen zu erleichtern entfernen zu trennen. Entfernen Sie das Gehirn und legen es in das Fläschchen mit Fixativ.

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zusätzliche Hinweise für eine erfolgreiche Operation: <ol><li> Sobald die Membran verletzt wird, vorausgehen schnell wie Hypoxie und Hyperkapnie wird irreversiblen physiologischen Veränderungen, die anschließende Analyse verfälschen können zu initiieren. </li><li> Wenn die Nadel eingeführt wird und eingespannt wird der Restdruck Blut der Basis der Nadel (Rückblende) zu drücken. In der Tat können größere Tiere zu vertreiben kräftig Blut. Es ist wichtig, dass Blut mindestens bis die Basis der Nadel zu vermeiden Einbringen von Luftblasen, die schädlich für Perfusion abzuschließen präsentieren. Wenn kein Blut an der Nadel Basis beobachtet wird, entfernen Sie die Nadel ab und füllen mit Puffer, indem Sie es mit der Auslassöffnung der Perfusion rig. Sobald Puffer hat durch die Spitze ausgeführt wurde, kann die Nadel in das Herz wieder eingesetzt werden. </li><li> Die richtige Platzierung der Nadel innerhalb der Aorta ist kritisch, sollte es nicht so weit wie der Aortenbogen erreichen. </li><li> Wenn mehrere Infusionen stattfinden ist es nicht notwendig to Einrichtung von Anfang an jedes Mal, wenn. Der Benutzer muss das richtige Volumen sowohl für den Puffer und Fixiermittel bei jeder Flasche (200 ml Tier / Lösung). Die Flaschen können auch wieder aufgefüllt, wenn nötig. Der wichtigste Aspekt ist Ausspülen der Perfusion Linie, die vom Setup für das Tier (Auslassventil) läuft. Nach dem Abschluss einer Perfusion, wird diese Zeile 4% Paraformaldehyd in ihm haben. Entfernen Sie den Schlauch von der Flasche Puffer und verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit Wasser gefüllt zu spülen, das Fixativ. Stellen Sie sicher, das Auslassventil in einem Becherglas Abfallsammlung für die ordnungsgemäße Entsorgung des Paraformaldehyd platziert wird. Wiederholen Sie dies dreimal. Refill mit Puffer mit der gleichen Methode in 2.3 dargestellt. </li><li> Dieses Verfahren zur Fixierung ist sehr anpassungsfähig mit der Fähigkeit, sowohl Puffer und Fixiermittel auch andere Fixierungsmittel (z. B. für EM verwendet) entsprechend den Anforderungen des Experiments zu ändern. </li><li> Das System wird auch häufig für die Extraktion von lebendem Gewebe verwendet. DazuVerfahren benutzt man einfach die Lieferung von Puffer nur (der Puffer Flasche, während immer noch auf ganze System angeschlossen ist in einem Eiskübel gestellt und das Fixativ Flasche ist leer, aber Setup als versiegelt). Dies gewährleistet eine kalte Perfusion Puffer an der optimalen Druck. Von hier aus kann das System zur Infusion von fixierbar Farbstoffe entweder durch Hinzufügen der Farbstoff direkt in den Zwischenspeicher (wenn die Menge kein Problem ist) oder eine Spritze mit einer minimalen Menge an Puffer / Farbstofflösung zwischen dem Puffer angepasst werden - Fixiermittel Schritt. </li><li> Bei vaskulären Gießen, ist die Drucküberwachung Puffer Schritt jedoch von entscheidender Bedeutung aufgrund der Viskosität und Verfestigen der Natur der Gießlösung entweder ein 50ml Spritze zur unmittelbaren Lieferung oder eine Einweg zweiten Befestigung der Vorrichtung verwendet werden (Schlauch, Ventil und hält Behälter) hat eine Schnittstelle mit dem aktuellen System verwendet werden. Unsere Labors &quot;vaskuläre Casting ging der Konstruktion und Fertigung des Perfusionsapparatur. Deshalb können wir nicht STgegessen, daß die Druckmessungen eine genaue Messung der Liefer-Site sein. Die Zahlen müssen eventuell angepasst, um eine erfolgreiche Bereitstellung von viskosen Flüssigkeiten zu erreichen. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Betäubungsmittel: </td></tr><tr><td> Ketamin / Xylazin-Mischung (Betäubungsmittel können je nach Labor / Institution variieren) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml Fläschchen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgie: </td></tr><tr><td> Nadelspitze, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Materiel Dienstleistungen </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Große stumpf / stumpf gebogenen Schere (~ 14,5 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Paar schöne (Graefe) Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 große Gefäßklemme Pinzette - gebogen oder gerade (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Standard Gefäßklemme Pinzette - gerade verzahnte (14 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 modifiziert Gefäßklemme (mit 15-Gauge-Loch durch die Spitze gestellt) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-Gauge-stumpf oder oliv-bestückte Nadel (Perfusion Nadel) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusion: </td></tr><tr><td> Hyperfusion System oder eine gleichwertige &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flache Schale aus Glas oder Kunststoff, ca. 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crushed Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Spritze </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair von Standard spitz / stumpf gerade Schere (~ 12 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Mittlere gebogen oder gerade Rongeure (14-16 cm) oder Schädelknochen Entfernung Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Gerade Iris Schere (~ 9 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro-Spatel (Doppel 2 &quot;flachen Enden, ein abgerundet, abgeschrägt, um ein 1/8&quot;) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Postfixierung &amp; Lagerung: </td></tr><tr><td> 50 ml Glasfläschchen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES-gepufferte Hanks-Lösung (HBHS) mit Natriumazid (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

Das Ziel der Fixierung ist es, schnell und gleichmäßig zu bewahren Gewebe in einem lebensbedrohlichen Zustand. Während die Platzierung direkt im Gewebe Fixativ eignet sich gut für kleine Gewebestücke, größere Exemplare wie die intakten Gehirn ein Problem darstellen, zum Eintauchen Fixierung, weil das Fixativ nicht erreicht, alle Regionen des Gewebes mit der gleichen Rate 5,7. Oft fangen sich in Reaktion auf Hypoxie, bevor das Gewebe 12 erhalten werden kann. Der Vorteil der direkt Perfusion Fixativ durch das Kreislaufsystem ist, dass die chemische lassen sich schnell erreichen jeden Winkel des Organismus mit dem natürlichen Kreislauf-Netz. Um den Kreislauf am besten zu nutzen, muss darauf geachtet werden, anzeigen lassen physiologischen Drücken 3. Es ist wichtig zu beachten, dass die physiologische Drücke abhängig von der verwendeten Art sind. Techniken für Perfusionsfixierung hängen von der zu fixierenden Gewebe abhängig und wie das Gewebe wird folgende Fixierung verarbeitet werden. In diesem Video, Beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns für die Immunhistochemie zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik (vs Schwerkraft-Systeme) ist, dass die Kreislauf-System am effektivsten genutzt wird.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

381.2K Aufrufe.  University of Michigan. Hier beschreiben wir eine kostengünstige, schnelle, kontrollierte und gleichmäßige Fixierung Verfahren unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd über das Gefäßsystem perfundiert: durch das Herz der Ratte, um die bestmögliche Erhaltung des Gehirns zu erhalten.

Serie: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Forschung

Medizin

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Neurowissenschaften

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To maintain the morphology of these delicate tissues, it is routine to administer a chemical fixative such as paraformaldehyde via cannulation of the heart in anesthetized animals (transcardial perfusion). Transcardial perfusion of the mouse heart has traditionally relied on the use of peristaltic pumps or air pressure to deliver both the saline and fixative solutions necessary for this process. As an easily accessible alternative to these methods, this work demonstrates the use of a gravity-fed method of perfusate delivery that uses materials available in most hardware stores. 
To validate this new perfusion method, this work demonstrates all the subsequent steps necessary for the sensitive detection of phosphorylated &#945;-synuclein in both the brain and spinal cord. Included in these steps are the dissection of the fixed brain and spinal cord tissues, rapid freezing/embedding and cryosectioning of the tissues, and immunofluorescent staining. As this method results in whole-body delivery of the fixative, it may also be used to prepare other non-neuronal tissues for histologic analysis.

A convenient gravity-fed perfusion method for histological analysis of the mouse central nervous system is presented. Immunofluorescent detection of phosphorylated &#945;-synuclein is demonstrated in a mouse model of Parkinson's disease. This work also comprehensively describes the transcardial perfusion, dissection, tissue freezing/embedding, and frozen sectioning steps.

Eine schwerkraftgespeiste transkardiale Perfusionsmethode zur histologischen Analyse des zentralen Nervensystems der Maus

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll für die Analyse der dendritischen Wirbelsäule mit Neurolucida 360

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed on dendritic spines. Dendritic spines are structures of great interest in research centered around synaptic plasticity, neurodevelopment, and neurological and psychiatric disorders. Dendritic spines undergo structural modifications during their lifespan, with properties such as total spine number, dendritic spine size, and morphologically defined subtype altering in response to different processes. Delineating the molecular mechanisms regulating these structural alterations of dendritic spines relies on morphological measurement. This mandates accurate and reproducible dendritic spine analysis to provide experimental evidence. The present study outlines a detailed protocol for dendritic spine quantification and classification using Neurolucida 360 (automatic three-dimensional neuron reconstruction software). This protocol allows for the determination of key dendritic spine properties such as total spine density, spine head volume, and classification into spine subtypes thus enabling effective analysis of dendritic spine structural phenotypes.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Optimierung der dendritischen Spine-Analyse für eine ausgewogene manuelle und automatisierte Beurteilung in den apikalen Dendriten des Hippoc

Dendritic spines are post-synaptic compartments of most excitatory synapses. Alterations to dendritic spine morphology occur during neurodevelopment, aging, learning, and many neurological and psychiatric disorders, underscoring the importance of reliable dendritic spine analysis. This protocol describes quantifying dendritic spine morphology accurately and reproducibly using automatic three-dimensional neuron reconstruction software.

Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...