Ce travail a été financé par le Centre pour les technologies de la communication neuronale (CNCT), un Centre de ressources P41 financée par l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et de bio-ingénierie (NIBIB, P41 EB002030) et soutenu par le National Institutes of Health (NIH).

1. Préparer fixateur (Voir Fixatif table et tampons.) 2. Préparation des tampons de perfusion (Voir Fixatif table et tampons.) 3. Préparer un appareil et d&#39;anesthésie <ol><li> Utilisation de l&#39;eau du bain, tampon de perfusion chaude à 37 ° C. Vanne de sortie Placer dans un bécher rempli de tampon. Remplir une seringue de 50 ml avec le tampon et le joindre à tube de fixateur. Rincer tube à plusieurs reprises par l&#39;expulsion et de retrait du tampon. </li><li> Effacer la ligne avec un tampon jusqu&#39;à ce que toutes les bulles d&#39;air dans le tube sont éliminés. Il est crucial pour le succès d&#39;une perfusion de ne pas avoir de bulles d&#39;air dans l&#39;une des lignes. </li><li> Retirer la seringue et connecter le fixateur du paraformaldéhyde à 4% (température ambiante) conteneur. Pour éviter les bulles d&#39;air à l&#39;extrémité du tuyau, presser le tube tout en positionnant le tube dans le récipient de telle sorte qu&#39;une goutte de tampon dépasse de la fin to contact avec la surface de fluide à l&#39;intérieur du récipient. </li><li> Fermer l&#39;orifice de sortie (extrémité de l&#39;aiguille). Tournez la vanne de tampon (bleu) à la même position que la soupape de fixateur (blanc). Cela permettra d&#39;écoulement de la ligne de tampon seul. </li><li> Ouvrez l&#39;orifice de sortie et répétez l&#39;étape A1 à A3 pour le remplissage de la ligne de tampon. Après toutes les bulles d&#39;air sont éliminées à proximité du port de sortie, retirer la seringue et raccorder le réservoir tampon, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Système de test pour la capacité à maintenir la pression en pompant le blub manomètre en caoutchouc. Il est normalement une résistance due à la compression de l&#39;air dans le système. </li><li> Configuration des outils de chirurgie pour que facile d&#39;accès. Remplir l&#39;aiguille de perfusion avec un tampon pour éliminer la possibilité de bulles d&#39;air. </li><li> Avant la chirurgie, un mélange kétamine / xylazine (jusqu&#39;à 80 mg / kg de poids corporel et de la kétamine 10 mg / kg de xylazine poids corporel) est administré par injection intrapéritonéale (aiguille de calibre 27 et 1 seringue cc). L&#39;administration du produit de l&#39;anesthésique est réalisée comme nécessaire au cours de chaque opération de maintenir un plan chirurgical de l&#39;anesthésie. </li></ol> 4. Chirurgie perfusion <ol><li> Une fois que l&#39;animal a atteint un plan chirurgical de l&#39;anesthésie, le placer sur le plateau peu profond rempli de glace pilée. (Utilisez orteil pincement réponse de la méthode pour déterminer la profondeur de l&#39;anesthésie. L&#39;animal doit être insensible avant de continuer). </li><li> Faire une incision latérale 5-6 cm à travers le tégument et la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique. Soin séparer le foie du diaphragme. </li><li> Faire une petite incision dans la membrane à l&#39;aide des courbes, ciseaux à bouts ronds. La position et la pression de votre doigt peut aider à la possibilité de couper la membrane. </li><li> Continuer l&#39;incision membrane sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. </li><li> Placez courbes, ciseaux à bouts ronds le long d&#39;un côté des nervures, soigneusement déplacer les poumons, et de faire une cut par le biais de la cage thoracique jusqu&#39;à la clavicule. Faites une coupe similaire sur le côté opposé. </li><li> Levée du sternum loin, couper avec précaution tout tissu de le connecter au coeur. Serrer la pointe du sternum à la pince hémostatique et placez la pince hémostatique sur la tête. Une fois fait correctement, le thymus se soulève du fond du cœur avec le sternum, fournissant une vue claire des principaux vaisseaux. </li><li> Faire une petite incision à l&#39;extrémité postérieure du ventricule gauche à l&#39;aide de ciseaux à iris. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <ol start="8"><li> Passez une aiguille de calibre 15 perfusion contondant ou d&#39;olive-pointe à travers le ventricule coupe dans l&#39;aorte ascendante. La pointe doit être visible à travers la paroi de l&#39;aorte, et ne devrait pas atteindre la crosse aortique, où les artères brachiales et carotides divergent. </li><li> Utilisez une pince hémostatique pour serrer le cœur, ce sécurise l&#39;aiguille et empêche les fuites. Si vous le souhaitez, la pince hémostatique modifié peut être utilisé pour bloquer l&#39;aorte autour de la pointe de l&#39;aiguille (ces hémostatiques restera en place jusqu&#39;à la dissection commence, mais ne figurent pas dans l&#39;avenir illustrations pour plus de clarté). </li><li> Enfin, faire une incision à l&#39;oreillette droite de l&#39;animal en utilisant des ciseaux à iris pour créer aussi grand que possible une prise sans endommager l&#39;aorte descendante. À ce stade, l&#39;animal est prêt à être perfusé. </li></ol> 5. Perfusion <ol><li> Ouvrez et joindre orifice de sortie de base de l&#39;aiguille en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air. </li><li> Pomper l&#39;ampoule à une pression manométrique de 80 mm Hg rapidement et uniformément. Maintenir cette pression pendant toute la durée de la perfusion de tampon. Démarrer la minuterie. </li><li> Ajustez l&#39;angle de l&#39;aiguille. L&#39;angle de l&#39;aiguille est essentiel à la réalisation d&#39;un débit maximal (noter le changement de flux avec réglage de l&#39;angle). </li><li> Mettez le buffer de valve (bleu), une fois de tampon est presque terminé (200 ml). Le liquide doit être claire courante. La compensation du foie est un indicateur d&#39;une bonne perfusion. Le foie doit être clair à ce stade. Indiquer le temps pour vos dossiers. </li><li> Tremblements de fixation doivent être observées en quelques secondes, ce qui devrait être considéré comme le véritable temps de fixation. Indiquer le temps pour vos dossiers. </li><li> La pression peut être progressivement augmenter jusqu&#39;à un maximum de 130 mm Hg 2 à maintenir un débit constant. </li><li> Fermez la vanne de sortie une fois que le fixateur est presque terminé. Indiquez l&#39;heure de fin pour vos dossiers. </li><li> Le rat doit être rigide à ce stade. </li><li> Le paraformaldéhyde utilisé doit être recueillies et stockées pour l&#39;élimination conformément aux règlements de votre établissement. </li></ol> 6. Dissection 4,11 <ol><li> Retirez la tête à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux. </li><li> Faire une incision médiane le long du tégument de la nuque au nez et à exposer lacrâne. </li><li> Coupez le muscle du cou restant de sorte que la base du crâne est exposé; enlever tout le muscle résiduel en utilisant ciseaux ou rongeurs. </li><li> Placez l&#39;extrémité pointue d&#39;une paire de ciseaux iris dans le foramen magnum d&#39;un côté, soigneusement glisser les ciseaux le long de la surface interne du crâne. </li><li> Ensuite, faire une découpe s&#39;étendant jusqu&#39;à la bordure distale de la surface du crâne postérieur. Faire une coupe identique sur le côté opposé. Utilisez les rongeurs pour déblayer le crâne autour du cervelet. </li><li> Faites glisser délicatement les ciseaux le long de la surface interne du crâne que la pointe se déplace à partir du coin dorsale postérieure distale jusqu&#39;à la bordure distale frontale du crâne, soulevant la lame que vous êtes de coupe pour éviter d&#39;endommager le cerveau. Répéter pour le côté opposé. </li><li> Utilisation de rongeurs peler la surface dorsale du crâne loin du cerveau. Rogner les côtés du crâne en utilisant ainsi rongeurs. </li><li> Avec une spatule, détacher les bulbes olfactifs et branchements nerveuxtions le long de la surface ventrale du cerveau. </li><li> Doucement taquiner le cerveau loin de la tête, coupe toute mère qui relie encore le cerveau du crâne avec des ciseaux à iris. </li><li> Enlever le cerveau et le placer dans un flacon de liquide fixateur contenant au moins 10x le volume du cerveau lui-même. Agiter le flacon de temps en temps. </li></ol> 7. Post-fixation et de stockage <ol><li> Gardez le cerveau dans un fixateur pendant 24 heures à 4 ° C, en agitant de temps en temps. </li><li> Après 24 heures, laver le cerveau avec du tampon phosphate salin en échangeant les 3 médias et tourbillonnant fois à chaque fois. </li><li> Brains peuvent ensuite être stockées en tampon phosphate salin ou HBHS avec l&#39;azoture de sodium et conservé à 4 ° C. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Un premier indicateur de la réussite de la perfusion est la compensation des extrémités comme le nez, les oreilles, les pattes et les organes internes tels que le thymus et le foie (IHC mondiale).L&#39;inspection brut du cerveau révèle le vide des vaisseaux sanguins du sang (blanc à l&#39;apparence jaune pâle). Ce sera également vrai au sein des sections de tissus destinera pour la coloration et l&#39;immunohistochimie. Le dernier indicateur de résultat de la perfusion est la condition de l&#39;ultrastructure dans le tissu. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Préparer fixatif: </td></tr><tr><td> Préparez le bouillon Paraformaldéhyde 8% </td></tr><tr><td><ol><li> Ajouter 40 g de paraformaldéhyde à 500 ml dH O. 2 Chauffer la solution à 60 - 65 ° C tout en agitant (Ne pas dépasser 65 ° C, cela peut nuire au succès de la procédure immunohistochimique). </li><li> Pour effacer la solution, réduire le feu et ajouter 2-3 ml de 1,0 M NaOH avec un compte-gouttes. </li><li> Filtrer et stocker à 4 ° C pour un maximum de 1 mois. </li></ol></td></tr><tr><td> Préparer tampon phosphate 0,2 M de sodium, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Pour le stock de phosphate de sodium monobasique, ajouter 27,8 g de NaH 2 PO 4 * H 2 O à 1 L dH O. 2 </li><li> Pour le stock de phosphate de sodium dibasique, ajouter 28,4 g de Na 2 HPO 4 à 1 L dH O. 2 </li><li> Ajouter 810 ml du stock monobasique à 190 ml du stock dibasique. </li></ol></td></tr><tr><td> Préparer Fixatif paraformaldéhyde 4% </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Ajouter parties égales de stock paraformaldéhyde 8% à tampon phosphate de sodium 0,2 M </li><li> Remarque: ce correctif est mieux préparés frais, pas plus de 72 heures à l&#39;avance. </li></ol></td></tr><tr><td> Préparer perfusion et tampons de stockage: </td></tr><tr><td> Préparer Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L dH 2 O </li><li> 9 g de NaCl </li><li> 144 mg de KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg de Na 2 HPO 4 </li><li> Vérifier le pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES tampon Hanks Solution (HBHS) avec un pH de l&#39;azoture de sodium 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7,5 g de NaCl, </li><li> 0,3 g de KCl </li><li> 0,06 g de KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g de dextrose / glucose </li><li> 2,4 g HEPES 10 mM </li><li> 0,1 g de MgCl 2 6 parties dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 pièces 7 dH 2 O </li><li> 0,165 g de CaCl 2 2 parties dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> Vérifier le pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Préparation de fixateur et de tampons. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figure 1. </strong&gt; Appareil de perfusion avec des composants marqués. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figure 2. Préparation de l&#39;appareil de perfusion I. Commencez par la ligne de fixateur. Rincer le tube de bulles d&#39;air et de remplir avec le tampon en mettant rapidement expulser et de retrait du tampon dans la seringue et par le biais de la ligne. Fermez la vanne sur la pointe d&#39;aiguille hors tension. Placez la ligne de fixateur dans la bouteille de fixateur sans introduire de bulles d&#39;air. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figure 3. Préparation de l&#39;appareil de perfusion II. 1. Ouvrir le robinet à l&#39;extrémité de l&#39;aiguille. 2. Tournez la vanne de tampon (bleu) pour positionner pour l&#39;écoulement. 3. Rincer le tube de bulles d&#39;air et de remplir avec le tampon en mettant rapidement expulser et de retrait du tampon avec la seringue. 4. Fermer le robinet à l&#39;extrémité de l&#39;aiguille. Placez le tube dans le flacon. Pression d&#39;épreuve pour s&#39;assurer que le système est scellé correctement par pompage jusqu&#39;à l&#39;ampoule manomètre et en observant le manomètre. L&#39;appareil est maintenant prêt pour la technique de perfusion. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figure 4. Appareil de perfusion en position pour la livraison de tampon. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figure 5. Perfusion Chirurgie I. a) Faire une incision latérale à travers le tégument et la paroi abdominale. b) Faire une incision dans la membrane et couper à travers la membrane d&#39;exposer le cœur. Faire des coupes parallèles de chaque côté des nervures jusqu&#39;à la clavicule. c) serrer la pointe du sternum avec la pince hémostatique et placer la pince hémostatique sur la tête. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figure 6. Chirurgie perfusion II. a) Passez l&#39;aiguille de perfusion à travers le ventricule coupe dans l&#39;aorte ascendante. b) Fixer lel&#39;utilisation de seringues de perfusion un ensemble de pinces hémostatiques pour serrer le cœur. Un second ensemble de pince hémostatique une modification peut également être utilisé pour serrer l&#39;aorte autour de la pointe de l&#39;aiguille à éviter les fuites. L&#39;aide de ciseaux iris faire une petite incision à l&#39;extrémité postérieure du ventricule gauche. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figure 7. Perfusion avec pompe tampon de l&#39;ampoule manomètre pour créer une pression dans la ligne. Ouvrez la vanne (1) et le joindre à l&#39;embout de l&#39;aiguille. Il est essentiel de s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont introduits. Pomper l&#39;ampoule à une pression manométrique de 80 mm de Hg et à maintenir cette pression pendant toute la période d&#39;infusion tampon. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figure 8. Perfusion avec fixateur fois tampon est presque terminé (200 ml) basculer la vanne de tampon (1) pour permettre le fixateur d&#39;écoulement. La pression peut être augmenté progressivement jusqu&#39;à unmaximale de 130 mm Hg. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> I. Dissection Figure 9. A) d&#39;enlever la tête en utilisant une paire de ciseaux. b) faire une incision dans la peau le long de la ligne médiane du cou au nez et à exposer le crâne. c) couper le muscle du cou restant de sorte que la base du crâne est exposé. Maintenez la tête de telle sorte que la grande ouverture dans la surface du crâne (foramen magnum) est accessible. Insérez soigneusement l&#39;extrémité pointue d&#39;une paire de ciseaux iris dans le foramen magnum et faire une coupe. Répéter la même manoeuvre pour le côté controlatéral. Utilisez les rongeurs pour déblayer le crâne autour du cervelet. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figure 10. Dissection II. a) faire glisser soigneusement les ciseaux le long de la surface intérieure du crâne. Soulevez la pointe que vous coupez pour éviter d&#39;endommager le cerveau. Répétez la même chose pour lescôté opposé. Utilisez rongeurs peau du crâne loin du cerveau. b) illustration avec le crâne et le cerveau enlevé exposés. c) utiliser une spatule pour couper les bulbes olfactifs et connexions nerveuses à l&#39;endroit le plus antérieur du cerveau. Guider avec précaution le long de la pointe de spatule dessous du cerveau pour couper les connexions pour la facilité de supprimer. Enlever le cerveau et le placer dans un flacon de fixateur.

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Notes complémentaires pour une chirurgie réussie: <ol><li> Une fois que le diaphragme est violé, faites précéder rapidement que l&#39;hypoxie et l&#39;hypercapnie lancera irréversibles des changements physiologiques qui peuvent confondre l&#39;analyse ultérieure. </li><li> Lorsque l&#39;aiguille est insérée et fixée en place, la pression résiduelle de pomper le sang à la base de l&#39;aiguille (retour de flamme). En fait, les plus gros animaux peuvent vigoureusement expulser le sang. Il est essentiel que le sang d&#39;au moins atteindre la base de l&#39;aiguille pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air qui constituent un obstacle à compléter la perfusion. Si le sang ne s&#39;observe à la base d&#39;aiguille, retirez l&#39;aiguille et le remplir avec un tampon en l&#39;attachant à l&#39;orifice de sortie de la plate-forme de perfusion. Une fois que la mémoire tampon a été exécuté par la pointe, l&#39;aiguille peut être réinséré dans le coeur. </li><li> Le positionnement correct de l&#39;aiguille dans l&#39;aorte est essentiel, il ne devrait pas aller aussi loin que la crosse aortique. </li><li> Si plusieurs perfusions sont en cours, elle n&#39;est pas nécessaire tconfiguration o dès le début à chaque fois. L&#39;utilisateur doit avoir le volume approprié pour les deux la mémoire tampon et de fixateur dans chaque bouteille (200mls animale / solution). Les bouteilles peuvent également être renouvelée si nécessaire. L&#39;aspect le plus important à considérer est débusquer la ligne de perfusion qui va de la mise en place à l&#39;animal (la valve de sortie). Après l&#39;achèvement d&#39;une perfusion, cette ligne aura paraformaldéhyde à 4% en elle. Retirez le tuyau de la bouteille tampon et utiliser une seringue de 50 ml remplie avec de l&#39;eau pour rincer le fixateur. Assurez-vous que la valve de sortie est placé dans un bécher de collecte des déchets pour une élimination appropriée de la paraformaldéhyde. Répétez ceci trois fois. Recharge avec un tampon en utilisant la même méthode indiquée au paragraphe 2.3. </li><li> Cette méthode de fixation est très adaptable à la capacité de modifier à la fois de tampon et de fixateur fixateurs d&#39;autres (tels que ceux utilisés pour les EM) selon les exigences de l&#39;expérience. </li><li> Le système est aussi fréquemment utilisé pour l&#39;extraction de tissu vivant. Pour cetteun procédé utilise seulement la livraison de tampon seule (mémoire tampon de la bouteille pendant encore fixé à ensemble du système est placé dans un seau et la bouteille fixateur est configuré comme vide, mais étanche). Ceci assure une perfusion tampon froid à la pression optimale. De là, le système peut être adapté à l&#39;infusion de colorants pouvant être fixés soit en ajoutant le colorant directement dans le tampon (si la quantité n&#39;est pas un problème) ou d&#39;utiliser une seringue avec une quantité minimale de tampon / solution de colorant dans la mémoire tampon entre - l&#39;étape de fixateur. </li><li> Dans le cas de la coulée vasculaire, l&#39;étape de tampon surveillance de la pression est toutefois fondamental en raison de la viscosité et la solidification de la nature de la solution de coulée soit une seringue de 50 ml doit être utilisé pour la livraison directe ou avec un accessoire jetable secondaire à l&#39;appareil (tuyau, la vanne et la tenue conteneur) fait l&#39;interface avec le système actuel être utilisé. Nos laboratoires de coulée des vasculaire précédé la conception et la fabrication de l&#39;appareil de perfusion. Par conséquent nous ne pouvons pas Stmangé que les mesures de pression sera une mesure précise sur le site de livraison. Les numéros peuvent être ajustées pour obtenir la livraison réussie de fluides visqueux. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anesthésique: </td></tr><tr><td> La kétamine / xylazine mélange (anesthésique peut varier selon le laboratoire / institution) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Flacon de 10 ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgie: </td></tr><tr><td> Pointe de l&#39;aiguille, 27 x GA 1.25 &quot; </td><td> Services du matériel </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Les grands ronds / ronds ciseaux courbes (environ 14,5 cm) </td><td> Outils belle science </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Droit Ciseaux Iris </td><td> Outils belle science </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Norme pincettes </td><td> Outils belle science </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Paire d&#39;amende (Graefe) pince à épiler </td><td> Outils belle science </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pince hémostatique grandes courbes ou droites - (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 pinces hémostatiques standards - droite dentelées (14 cm) </td><td> Outils belle science </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pince hémostatique modifié (avec de calibre 15 trous déposée par l&#39;intermédiaire de la pointe) </td><td> Outils belle science </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-aiguille de calibre contondant ou d&#39;olive-pointe (aiguille de perfusion) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusion: </td></tr><tr><td> Système HyPerfusion ou l&#39;équivalent &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> En verre peu profond ou un plateau en plastique, environ 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La glace concassée </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bain-marie (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Minuteur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 50 ml </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pennsylvanieir des standards pointus / mousses ciseaux droits (~ 12 cm) </td><td> Outils belle science </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Moyen rongeurs courbes ou droites (14-16 cm) ou des pinces os du crâne de déménagement </td><td> Outils belle science </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Droit Ciseaux Iris (~ 9 cm) </td><td> Outils belle science </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-spatule (2 doubles &quot;extrémités plates, l&#39;une arrondie, un conique à 1/8&quot;) </td><td> Outils belle science </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Post-fixation et de stockage: </td></tr><tr><td> Flacon de 50 ml en verre </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml de HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) avec de l&#39;azoture de sodium (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

Le but de la fixation est de rapidement et uniformément préserver le tissu dans un état de vie, comme. En plaçant le tissu directement dans les œuvres de fixateur bien pour de petits morceaux de tissus, les plus grands spécimens, comme le cerveau intact poser un problème pour la fixation d&#39;immersion parce que le fixateur ne parvient pas à toutes les régions du tissu à la même vitesse 5,7. Souvent, les changements en réponse à l&#39;hypoxie commencer avant le tissu peut être conservé 12. L&#39;avantage de perfusion directement fixateur à travers le système circulatoire est que le produit chimique peut rapidement atteindre tous les coins de l&#39;organisme en utilisant le réseau naturel vasculaire. Afin de pouvoir utiliser le système circulatoire le plus efficacement possible, il faut prendre soin pour correspondre à des pressions physiologiques 3. Il est important de noter que les pressions physiologiques sont dépendantes des espèces utilisées. Techniques pour la fixation de perfusion varient en fonction du tissu à fixer et comment le tissu seront traitées après fixation. Dans cette vidéo,, Nous décrivons un faible coût, rapide, procédure de fixation contrôlée et uniforme à l&#39;aide de paraformaldéhyde à 4% perfusé par le système vasculaire: à travers le cœur du rat pour obtenir la meilleure conservation possible du cerveau pour l&#39;immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique (vs systèmes gravitaires d&#39;adduction), c&#39;est que le système circulatoire est utilisé le plus efficacement possible.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Nous décrivons ici un faible coût, rapide, procédure de fixation contrôlée et uniforme à l&#39;aide de paraformaldéhyde à 4% perfusé par le système vasculaire: à travers le cœur du rat pour obtenir la meilleure conservation possible du cerveau.

Whole fixation par perfusion des animaux pour rongeurs

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.8K vues.  University of Michigan. Nous décrivons ici un faible coût, rapide, procédure de fixation contrôlée et uniforme à l'aide de paraformaldéhyde à 4% perfusé par le système vasculaire: à travers le cœur du rat pour obtenir la meilleure conservation possible du cerveau.

Vidéo: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Lecture automatique Interactive Video pour les études de la communication animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Recherche

Neurosciences

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgie stéréotaxique rongeurs et des améliorations pour la protection des animaux Résultat Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

À grande échelle d&#39;enregistrement des neurones par des sondes de silicium mobiles à se comporter Rongeurs

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

Une configuration à faible coût pour l&#39;audiométrie comportementale chez les rongeurs

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Enregistrement et analyse des rythmes circadiens dans la course roue-activité chez les rongeurs

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimulation cérébrale profonde avec simultanée IRMf chez les rongeurs

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Acrylique mouler à base Chef Fixation Technique chez les rongeurs

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Implantation de la canule dans la Magna de Cisterna de rongeurs

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...