Name: whole animal perfusion fixation for rodents
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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이 작품은 신경 통신 기술을위한 센터 (CNCT), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB, P41 EB002030)에 의해 재정 지원과 국립 보건원 (NIH)에서 지원하는 P41 자원 센터에 의해 재정 지원되었다.

1. 정착액 준비 (테이블 정착액 및 버퍼를 참조하십시오.) 2. 재관류 버퍼를 준비합니다 (테이블 정착액 및 버퍼를 참조하십시오.) 3. 장치 및 마취 준비 <ol><li> 37에 물 목욕, 따뜻한 재관류 버퍼를 사용 ° C. 버퍼로 가득 비커에서 개최 출구 밸브. 버퍼와 50 ML의 주사기를 입력하고 고정력있는 튜브에 첨부합니다. 추방과 버퍼를 철수하여 반복적으로 튜브를 플러시. </li><li> 튜빙의 모든 공기 방울을 제거 때까지 버퍼와 선을 지웁니다. 그것은 라인의에 공기 방울을하지 않는 관류의 성공을 위해 매우 중요합니다. </li><li> 주사기를 제거하고 4 % paraformaldehyde의 정착액 (실내 온도) 컨테이너를 연결합니다. 용기에 튜브를 배치한 상태에서 튜브 끝에 공기 방울을 피하기 위해 튜브를 당겨 그래야 최종 t에서 버퍼 protrudes 한 방울용기 내의 액체 표면에 문의 O. </li><li> 아울렛 포트 (바늘 끝)를 닫습니다. 정착액 밸브 (흰색)와 동일한 위치에 버퍼 밸브 (파란색)을 돌립니다. 이것은 버퍼 라인에서만의 흐름을 수 있습니다. </li><li> 아울렛 포트를 열고 버퍼 라인 작성을위한 대답을 통해 A1 단계를 반복합니다. 모든 공기 방울이 가까운 아울렛 포트를 제거 후, ​​주사기를 제거하고 버퍼 컨테이너를 연결한 튜브에 공기 방울을 소개하지 않도록 관리 하는것. </li><li> 고무 혈압계의 blub를 주입하여 압력을 보유 능력을위한 테스트 시스템입니다. 시스템의 공기 압축으로 인해 일부 저항은 일반적으로있다. </li><li> 접근의 용이 위해서는 수술 도구를 설치합니다. 공기 거품의 가능성을 제거하기 위해 버퍼로 관류 바늘을 채웁니다. </li><li> 이전 수술에, xylazine / 마취제 혼합물은 (최대 80 밀리그램 / kg 체중의 마취제 및 10 밀리그램 / kg 체중의 xylazine) intraperitoneal 주사 (27 게이지 바늘과 1 CC의 주사기)를 통해 관리합니다. 마취의 추가 관리는 마취의 수술 비행기를 유지하기 위해 각 작업 과정 중에 필요에 따라 수행됩니다. </li></ol> 4. 재관류 수술 <ol><li> 동물 마취의 수술 비행기에 도달되면 얼음 조각으로 가득 얕은 쟁반에 배치하십시오. (마취의 깊이를 결정하는 핀치 - 응답 방식 발가락을 사용합니다. 동물 계속하기 전에 응답해야합니다.) </li><li> 그냥 흉곽 아래 외피와 복벽을 통해 5-6cm 측면 절개를합니다. 피임기구로부터 간을 조심스럽게 분리. </li><li> 곡선, 무딘 가위를 사용하여 다이어프램의 작은 절개를합니다. 손가락의 위치와 압력은 다이어프램자를 수있는 능력을 도울 수 있습니다. </li><li> 흉막 캐비티를 노출하는 흉곽의 전체 길이를 따라 격막 절개를 계속합니다. </li><li> 신중하게 폐가 생기죠, 갈비뼈 한쪽을 따라 곡선, 무딘 가위를 삽입하고, 세제곱하다최대 쇄골까지 갈빗대를 통해 t. contralateral 측면에서 유사한 몫을합니다. </li><li> 멀리 흉골을 리프팅하는 것은 마음에 그것을 연결하는 모든 조직을 조심스럽게 잘라. hemostat과 흉골의 끝부분을 고정하고 머리 hemostat를 놓습니다. 정상적으로 완료되면, thymus는 주요 혈관의 명확한 전망을 제공 흉골과 함께 마음에서 떨어져 올렸으니까요. </li><li> 홍채 가위를 사용하여 좌심실 후부 끝에 작은 절개를합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <ol start="8"><li> 오름차순 대동맥에 상처 뇌실을 통해 15 게이지 무딘 또는 올리브-스쳐 재관류 바늘을 전달합니다. 팁이 대동맥의 벽을 통해 볼 수 있어야하고, 상완과 경동맥 동맥이 갈리는 대동맥 아치에 도달해서는 안됩니다. </li><li> 마음을 클램프하는 hemostat를 사용하여,이 바늘을 확보하고 유출을 방지합니다. 원하는 경우 수정한 hemostat가 (이 hemostats은 절개가 시작하기 전까지 자리에 남아 있지만, 지혜로움에 대해 미래의 그림에서 생략) 바늘 끝 주위 대동맥 클램프하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 마지막으로, 하강 대동맥을 손상시키지 않고 가능한 한 대형 할인 매장을 만들 홍채 가위를 사용하여 동물의 권리 아트리움에 절개를합니다. 이 시점에서 동물 perfused받을 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 관류 <ol><li> 열고있는 공기 방울을 소개하지 돌보는 바늘 기지로 아울렛 포트를 연결합니다. </li><li> 신속 &amp; 고르게 80mm의 HG의 압력에 혈압계 벌브 속도를 높여. 버퍼 주입 기간에 걸쳐이 압력을 유지한다. 타이머를 시작합니다. </li><li> 바늘 각도를 조정하십시오. 바늘의 각도가 최대 유량 (각도 조정 기능과 흐름의 변화에​​ 유의)의 성과에 중요합니다. </li><li> 광 스위치어 밸브 (파란색) 버퍼가 거의 완료되면 (200 ML). 액체는 분명 실행해야합니다. 간장의 개간은 좋은 재관류의 지표입니다. 간은이 시점에서 명확해야합니다. 기록 시간을 나타냅니다. </li><li> 고정 떨림은 초 내에 관찰해야합니다, 이것은 고정의 진정한 시간을 고려해야합니다. 기록 시간을 나타냅니다. </li><li> 압력은 점차 안정된 유량을 유지하기 위해 130mm HG 2의 최대까지 늘릴 수 있습니다. </li><li> 정착액가 거의 완료되면 배출구 밸브를 닫습니다. 기록 시간이 종료되었음을 나타냅니다. </li><li> 쥐이 단계에서 치열한 여야합니다. </li><li> 사용 paraformaldehyde는 기관의 규정에 따라 처리를 위해 수집하여 저장해야합니다. </li></ol> 6. 해부 4,11 <ol><li> 가위를 사용하여 머리를 제거합니다. </li><li> 목에 코로 외피를 따라 중간선 절개를 만들어 노출두개골. </li><li> 두개골의 바닥이 노출되어 있도록 남은 목 근육을 손질, 가위 또는 rongeurs를 사용하여 잔류 근육을 제거합니다. </li><li> 신중하게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위 슬라이딩, 한쪽에 구멍 매그넘으로 홍채 가위의 날카로운 끝을 놓으십시오. </li><li> 다음, 상처 후부 두개골 표면의 말초 가장자리로 연장합니다. contralateral 측면에 동일한 몫을합니다. 소뇌 주위 두개골을 멀리 취소 rongeurs을 사용합니다. </li><li> 끝 당신이 뇌에 손상을 방지하기 위해 절단되면서 칼날에 리프팅, 지느러미 말초 후부 코너에서 두개골의 말초 전두엽 가장자리에 여행으로 조심스럽게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위를 끼웁니다. 반대편에 대해 반복합니다. </li><li> 두뇌에서 떨어져 두개골 등 부분의 표면을 보지 rongeurs 사용하기. rongeurs을뿐만 아니라 사용하는 두개골의 측면을 떠나 트림. </li><li> 주걱 사용하여 후각 구근과 불안 connec를 끊다두뇌의 복부 표면에 따라 tions. </li><li> 부드럽게 아직도 홍채 가위를 사용하여 두개골에 두뇌를 연결하는 경질을 트리밍, 멀리 머리에서 머리를 조르다. </li><li> 두뇌를 제거하고 정착액 함유 유체 뇌 자체의 볼륨이 최소 10X의 유리병에 넣습니다. 유리병 가끔 소용돌이. </li></ol> 7. 이후 고정 및 보관 <ol><li> 가끔 소용돌이, 4 ° C에서 24 시간 동안 정착액의 뇌는 보관하십시오. </li><li> 24 시간 이내에, 인산과 뇌를 씻어 것은 언론 3 회 교환하고 각 시간을 소용돌이에 의한 염분 버퍼. </li><li> 머리가 그때 인산에 저장될 수있는 건 나트륨 azide와 염분이나 HBHS 버퍼와 4에서 보관 ° C. </li></ol> 8. 대표 결과 관류의 성공의 초기 지표는 코와 같은 사지, 귀 및 발냄새와 같은 thymus 글랜드 및 간장 (IHC 세계)와 같은 내부 장기의 개간이다.두뇌의 그로스 검사는 혈액 (연한 노란색 외관 흰색)의 혈관 무효를 보여준다. 이 염색법과 immunohistochemistry를위한 예정해 두다 조직 섹션 내에 사실이기도합니다. 관류의 결과의 마지막 지표는 조직의 ultrastructure의 조건이다. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> 정착액 준비 : </td></tr><tr><td> 8 % Paraformaldehyde 주식 준비 </td></tr><tr><td><ol><li> 500 ML DH 2 O.로 40g의 Paraformaldehyde 추가 60 솔루션을 가열 - 65 ° C (65을 초과하지 마십시오 ° C, 이렇게 부정적인 immunohistochemical 절차의 성공에 영향을 미칠 수) 교반하면서. </li><li> 솔루션을 지우려면 열을 줄이고 dropper로 1.0 M NaOH로부터 2-3 ML을 추가합니다. </li><li> 필터 및 최대 1 개월 4 ° C에서 저장합니다. </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 M의 인산 나트륨 버퍼, 산도 7.4을 준비한다 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> 인산 나트륨 일염기의 주식의 경우, 1 패 DH 2 O.로 27.8 g 아뇨 2 PO 4 * H 2 O를 추가하십시오 </li><li> 인산 나트륨 이염 주식의 경우, 1 패 DH 2 O.로 28.4 g 나 2 HPO 4를 추가 </li><li> 이염 주식 190 ML에 일염기의 주식 810 ML을 추가합니다. </li></ol></td></tr><tr><td> 4 % Paraformaldehyde의 정착액을 준비 </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> 0.2M 인산 나트륨 버퍼에 동일 부위에게 8 % paraformaldehyde 주식 추가 </li><li> 참고 :이 수정 프로그램은 최상 더 이상 72 이상의 시간 사전에 신선한 준비가되어 있습니다. </li></ol></td></tr><tr><td> 관류 및 스토리지 버퍼를 준비합니다 : </td></tr><tr><td> 인산 준비는 식염, 산도 7.4 버퍼 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 패 DH 2 O </li><li> 9g NaCl </li><li> 144 MG KH 2 PO &lt;서브&gt; 4 </li><li> 795 MG 나 2 HPO 4 </li><li> 산도를 확인 </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES는 나트륨 Azide의 산도 7.4으로 행크스 솔루션 (HBHS)를 버퍼 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ML DH 2 O </li><li> 7.5 g NaCl, </li><li> 0.3 g KCl </li><li> 0.06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0.13 g 나 2 HPO 4 </li><li> 2g 우선당 / 포도당 </li><li> 2.4 g 10mm의 Hepes </li><li> 0.1 g MgCl 2 6 부분 DH 2 O </li><li> 0.05 g MgSO 4 7 부품 DH 2 O </li><li> 0.165 g CaCl 2 부분 DH 2 O </li><li> 90 MG 앤 3 </li><li> 산도를 확인 </li></ol></td></tr></tbody></table> 표 1. 정착액 및 버퍼의 작성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> 1 그림. </stronG&gt; 레이블 구성 요소 관류 장치. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> 그림 2. 관류 장치 전의 준비 고정력있는 라인으로 시작. 공기 거품의 튜브를 플러시하고 빠르게 추방과 주사기로 및 회선을 통해 버퍼를 철수하여 버퍼에 기입하십시오. 바늘 끝에 밸브를 닫아. 공기 방울을 도입하지 않고 정착액 병에 정착액 라인을 놓습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 그림 3. 관류 장치 II의 준비. 1. 바늘 끝에 밸브를 엽니다. 2. 흐름을 위해 자리를 버퍼 밸브 (파란색)을 돌립니다. 3. 공기 거품의 튜브를 플러시하고 빠르게 추방과 주사기로 버퍼를 철수하여 버퍼에 기입하십시오. 4. 바늘 끝에 밸브를 닫습니다. 버퍼 병 속으로 튜브를 놓습니다. 시스템이 올바른 밀폐되고 있는지 확인하는 시험 압력혈압계 벌브를 펌핑하고 게이지를 보면서 요. 장치는 이제 재관류 절차에 대한 준비가되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 그림 4. 버퍼 제공을위한 위치에 관류 장치. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> 그림 5. 재관류 수술 전)는 외피와 복벽을 통해 가로 절개를합니다. B) 다이어프램의 절개를 만들어 심장을 노출 다이어프램 가로질러. 최대 쇄골까지 갈비의 양쪽에 평행 상처를 확인하십시오. C) hemostat과 흉골의 팁 클램프 및 머리 hemostat를 놓습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> 그림 6. 재관류 수술 II. ) 오름차순 대동맥으로 절단 뇌실을 통해 관류 바늘을 전달합니다. B)를 확보마음을 클램프하는 hemostats의 재관류 바늘 하나를 사용 세트. 수정된 hemostat의 두 번째 세트도 누설을 방지하기 위해 바늘 끝 주위 대동맥 클램프하는 데 사용할 수 있습니다. 홍채 가위를 사용하면 좌심실 후부 끝에 작은 절개를합니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> 그림 7. 버퍼 펌프 라인의 압력을 만듭니다 혈압계 벌브와 재관류. 밸브 (1) 최대 열고 바늘 허브에 첨부합니다. 그것은 기포가 도입되지 않도록 중요합니다. 80mm HG의 압력에 혈압계 벌브를 펌프 및 버퍼 주입 기간에 걸쳐이 압력을 유지합니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> 그림 8. 버퍼 후에는 정착액과 재관류는 거의 (200 ML)이 흐름에 정착액 수 있도록 버퍼 밸브 (1) 전환 완료됩니다. 압력이 점차까지 늘릴 수 있습니다130mm HG 최대. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> 그림 9. 절개의 나) 가위의 쌍을 사용하여 머리를 제거합니다. 나) 목에 코에 중간선을 따라 피부 절개를하고 두개골을 노출. 두개골의 바닥이 노출되어 있도록 C) 남아있는 목 근육을 잘라. 태아의 두개골 표면에서 대형 오프닝 (구멍의 매그넘)가 접근할 수 있도록 머리를 잡아. 조심스럽게 구멍의 매그넘으로 홍채 가위의 날카로운 끝부분을 삽입하고 몫을합니다. contralateral 측면에 대해 동일한 책략을 반복합니다. 소뇌 주위 두개골을 멀리 취소 rongeurs을 사용합니다. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> 10 그림. 해부 II는. ) 조심스럽게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위를 끼웁니다. 당신은 뇌에 손상을 방지하기 위해 절단되면서 끝에 올려요. 동일 작업을 반복반대편. 두뇌에서 떨어져 두개골 껍질 rongeurs을 사용합니다. B) 두개골 그림은 제거되고 두뇌 노출. C) 뇌의 가장 앞쪽에 위치에서 후각 전구와 신경 연결을 도려 내야 주걱을 사용합니다. 조심스럽게 제거의 용이성을 위해 연결을 끊을 수있는 뇌의 아래쪽을 따라 주걱 팁을지도. 두뇌를 제거하고 정착액의 유리병에 넣습니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

성공적인 수술을위한 추가 사항 : <ol><li> 다이어프램이 돌파되면 hypoxia와 hypercapnia는 후속 분석을 먹이고 있습니다 돌이킬 수없는 생리적 변화를 시작하므로 급속 앞에. </li><li> 바늘 삽입과 장소에 채워되면 잔류 압력 바늘 (플래시백)의 기지로 혈액을 밀어 것입니다. 사실, 큰 동물은 강력하게 혈액을 퇴학 수 있습니다. 그것은 피가 적어도 재관류를 완료하려면 장애물들을 제시하고 공기 방울을 도입 피하기 위해 바늘의 기준에 도달할 것이 중요합니다. 더 피를 바늘 기지에서 관찰되지 않은 경우 재관류의 장비의 아울렛 포트를 첨부하여 버퍼와 함께 바늘과 리필을 제거하십시오. 버퍼 팁을 통해 실행되면 바늘이 심장으로 다시 삽입하실 수 있습니다. </li><li> 대동맥 내에서 바늘의 적절한 배치가 중요하다, 그것까지 대동맥 아치 등에 도달할 수 없습니다. </li><li> 여러 perfusions가 일어나고있다면 그것은 필요하지 않습니다처음 때마다부터 O 설정. 사용자는 각 병 (200mls 동물 / 솔루션)에서 버퍼와 정착액 모두에 적절한 볼륨을 가지고 있어야합니다. 필요한 경우 병도 리필하실 수 있습니다. 고려해야 할 가장 중요한 부분은 동물에 대한 설정 (출력 밸브)에서 실행 재관류 라인을 플러시합니다. 관류의 완료 후,이 라인은 거기에 4 % paraformaldehyde를해야합니다. 버퍼 병에서 튜브를 제거하고 정착액을 플러시 물로 채워진 50 ML의 주사기를 사용합니다. 아웃렛 밸브는 paraformaldehyde의 적절한 처리를위한 폐기물 수거 비커에 배치되어 있는지 확인하십시오. 이 세 번 반복합니다. 2.3에 표시된 동일한 방법을 사용하여 버퍼로 리필. </li><li> 고정을위한이 방법은 실험의 요구에 따라 버퍼와 정착액 기타 fixatives (예 : EM에 사용되는 것과 같은)을 모두 변경할 수있는 능력을 갖춘 고도의 적응이다. </li><li> 시스템은 또한 자주 살아있는 조직의 추출에 사용됩니다. 이것에 대한프로세스 하나는 단순히 버퍼의 전송을 사용하여 전용 (여전히 전체 시스템에 부착된 상태에서 버퍼 병은 아이스 버킷에 배치하고 정착액 병이 비어 있지만 밀폐된 같은 설정입니다.) 이것은 최적의 압력에 감기 버퍼 재관류를 보장합니다. 여기에서 시스템 중 (수량이 문제가 아닌 경우) 버퍼로 직접 염료를 추가하거나 버퍼 / 버퍼 사이에 염료 용액의 최소한의 금액으로 주사기를 사용하여 고칠수 염료의 주입에 적용할 수 있습니다 - 고정력있는 단계. </li><li> 혈관 캐스팅의 경우, 압력 모니터링 버퍼 단계 50ml 주사기 하나가 (튜브, 밸브 및 유지 장치로 직접 전송하거나 일회용 보조 첨부 파일을 사용해야하지만 점도와 주조 솔루션의 본질을 응고로 인한 중요합니다 현재의 시스템과 인터페이스로 만든 컨테이너)가 사용됩니다. 저희 실험실 &#39;혈관 캐스팅은 관류 장치의 설계 및 제조에 앞서. 따라서 우리는 일 수 없다압력 측정 배달 사이트에서 정확한 측정 될 것이라고 먹었다. 번호는 점성 유체의 성공적인 전송을 달성하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 마취제 : </td></tr><tr><td> 케타민을 / xylazine 혼합물 (마취가 실험실 / 기관에 따라 다를 수 있음) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ML의 유리병 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 외과 : </td></tr><tr><td> 니들 팁 (27) GA X 1.25 &quot; </td><td> Materiel 서비스 </td><td> 25,251 </td><td></td></tr><tr><td> 대형 무딘 / 뭉툭한 굽은 가위 (~ 14.5 ㎝) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> 스트레이트 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 일반 핀셋 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> 고급 (Graefe) 족집게의 페어 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 한 대형 hemostat의 포셉 - 곡선이나 직선 (~ 19cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 표준 hemostat의 포셉 - 직진 톱니 모양 (14 ㎝) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 한 수정 hemostat (팁을 통해 제기한 15 게이지 구멍이있는) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15 게이지 무딘 또는 올리브-스쳐 바늘 (재관류 바늘) </td><td> Fisnar </td><td> 5,601,137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 관류 : </td></tr><tr><td> HyPerfusion 시스템 또는 동급 &lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염수, 산도 7.4 버퍼 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1 M 인산 버퍼, 산도 7.4의 4 % Paraformaldehyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 얕은 유리 또는 플라스틱 트레이, 약 10 &quot;X 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 얼음 조각 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 물 목욕 (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 타이머 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 주사기 </td><td> MEDLINE 산업 </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 해부 : </td></tr><tr><td> 아빠표준 날카로운 / 둔하게 스트레이트 가위 IR (~ 12 ㎝) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> 중간 곡선 또는 직선 rongeurs (14~16cm) 또는 두개골 뼈 제거 펜치 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> 스트레이트 아이리스 가위 (~ 9 ㎝) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 주걱 (더블 2 &quot;평면 끝을 하나는 둥근, 테이퍼 1 ~ 10 / 8&quot;) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 이후 고정 및 보관 : </td></tr><tr><td> 50 ML의 유리관 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide 40 ML HEPES-버퍼 행크스 솔루션 (HBHS) (90mg / L) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbodY&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

고정의 목표는 빠르고 균일하게 실제와 같은 상태로 조직을 보존하는 것입니다. 정착액은 같은 속도 5,7에서 조직의 모든 영역에 도달하지 못하기 때문에 조직의 작은 조각, 손상 뇌 침지 고정에 대한 문제 제기와 같은 큰 표본에 대해 잘 정착액 작품에서 직접 조직을 놓는 동안. 조직은 12 보존할 수 전에 종종 hypoxia에 대한 응답의 변화가 시작되었습니다. 직접 순환 시스템을 통해 정착액을 perfusing의 장점은 화학 물질을 빠르게 자연 혈관 네트워크를 사용 유기체의 모든 모서리에 도달할 수있다는 것입니다. 가장 효과적으로 순환 시스템을 활용하기 위해서는주의가 생리적 압력에게 3 일치하도록 이동해야합니다. 그것은 생리적 압력 사용한 종에 의존 점에 유의하는 것이 중요합니다. 관류 고정을위한 기술은 고정되는 조직에 따라 다릅니다 방법과 조직은 다음과 같은 고정가 처리됩니다. 이 동영상에서쥐의 심장을 통해 immunohistochemistry에 대한 뇌의 최상의 보존을 구하려면, 우리는 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다. 이 기법의 가장 큰 장점 (대 무게로 자란 시스템) 순환 시스템이 가장 효과적으로 활용되고있다는 것입니다.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

쥐의 심장을 통해 두뇌의 최상의 보존을 구하려면 여기 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다.

설치류에 대한 전체 동물 관류 고정

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

381.2K 조회수.  University of Michigan. 쥐의 심장을 통해 두뇌의 최상의 보존을 구하려면 여기 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다.

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2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2 혈관 폐색 / 저혈압 : 세계적인 두뇌 국소 빈혈의 쥐 모델

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

연구

의학

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

신경과학

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

마우스 뇌 에서 생체 내 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To maintain the morphology of these delicate tissues, it is routine to administer a chemical fixative such as paraformaldehyde via cannulation of the heart in anesthetized animals (transcardial perfusion). Transcardial perfusion of the mouse heart has traditionally relied on the use of peristaltic pumps or air pressure to deliver both the saline and fixative solutions necessary for this process. As an easily accessible alternative to these methods, this work demonstrates the use of a gravity-fed method of perfusate delivery that uses materials available in most hardware stores. 
To validate this new perfusion method, this work demonstrates all the subsequent steps necessary for the sensitive detection of phosphorylated &#945;-synuclein in both the brain and spinal cord. Included in these steps are the dissection of the fixed brain and spinal cord tissues, rapid freezing/embedding and cryosectioning of the tissues, and immunofluorescent staining. As this method results in whole-body delivery of the fixative, it may also be used to prepare other non-neuronal tissues for histologic analysis.

A convenient gravity-fed perfusion method for histological analysis of the mouse central nervous system is presented. Immunofluorescent detection of phosphorylated &#945;-synuclein is demonstrated in a mouse model of Parkinson's disease. This work also comprehensively describes the transcardial perfusion, dissection, tissue freezing/embedding, and frozen sectioning steps.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

<meta charset="utf8"></head><body>Neurolucida 360을 사용한 수지상 척추 분석 프로토콜

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed on dendritic spines. Dendritic spines are structures of great interest in research centered around synaptic plasticity, neurodevelopment, and neurological and psychiatric disorders. Dendritic spines undergo structural modifications during their lifespan, with properties such as total spine number, dendritic spine size, and morphologically defined subtype altering in response to different processes. Delineating the molecular mechanisms regulating these structural alterations of dendritic spines relies on morphological measurement. This mandates accurate and reproducible dendritic spine analysis to provide experimental evidence. The present study outlines a detailed protocol for dendritic spine quantification and classification using Neurolucida 360 (automatic three-dimensional neuron reconstruction software). This protocol allows for the determination of key dendritic spine properties such as total spine density, spine head volume, and classification into spine subtypes thus enabling effective analysis of dendritic spine structural phenotypes.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Optimizing Dendritic Spine Analysis for Balanced Manual and Automated Assessment in the Hippocampus CA1 Apical Dendrites (해마 CA1 정점 수상돌기에서 균형 잡힌 수동 및 자동

Dendritic spines are post-synaptic compartments of most excitatory synapses. Alterations to dendritic spine morphology occur during neurodevelopment, aging, learning, and many neurological and psychiatric disorders, underscoring the importance of reliable dendritic spine analysis. This protocol describes quantifying dendritic spine morphology accurately and reproducibly using automatic three-dimensional neuron reconstruction software.

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...