Damos las gracias a Olivier Vallon para el antisuero contra CF1β. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck y becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (Sistemas de Biología FORSYS Iniciativa, GoFORSYS del proyecto).

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Recientemente hemos introducido dos mejoras en el enfoque rápidos: una etapa de reticulación para capturar transitorios interacciones proteína-proteína (QUICK-X), y una precipitación de control para normalizar la eficiencia de precipitación desiguales 6. Aquí presentamos un protocolo que contiene dos mejoras más de Quick: en primer lugar, sustituimos SILAC 5 para 15 N marcaje metabólico. Las ventajas son que 15 N marcaje metabólico es mucho más barato que el SILAC, si 15 N se proporciona en forma de sal inorgánica simple. Además, con 15 N metabólica rotulación rápida se puede aplicar a organismos prototrófica para todos los aminoácidos, como la mayoría de las plantas, hongos y bacterias. Y finalmente, la arginina-a-prolina interconversión inherente a 5,6 SILAC no presenta un problema para la cuantificación de 15 N péptidos marcados. Ejemplos de instrumentos adecuados para la evaluación cuantitativa de los 15 datos de la proteómica N son MSQUANT 12 o IOMIQS 13. En segundo lugar, se introduce la modulación de afinidad como un medio para reducir específicamente la cantidad de proteínas que interactúan con una proteína diana dada en una muestra frente a otra. Las ventajas de este enfoque son que evita la construcción de mutantes desmontables, lo que para algunos sistemas modelo son difíciles de generar o no puede ser generado en absoluto en el caso de proteínas diana esenciales. Además, evita interpretaciones erróneas causadas por la expresión diferencial de proteínas potencialmente presentes como una respuesta de la célula a golpear hacia abajo una proteína diana: si otras proteínas son las reguladas así y reaccionar de forma cruzada con el antisuero usado para la inmunoprecipitación, que sería interpretado como verdaderos compañeros de interacción de la proteína diana. Por último, la afinidad de modulación elimina la necesidad de encontrar un adecuado anticuerpo-antígeno a-ratio. A pesar de que aplicar el protocolo de Chlamydomonas reinhardtii como organismo modelo, Que puede ser fácilmente adaptado a cualquier otro organismo que se puede cultivar en cultivo celular y es capaz de utilizar de amonio o nitrato como fuente de nitrógeno. Modulación afinidad de los complejos de proteínas por ATP / ADP directamente se puede aplicar a otras chaperonas cuya interacción con los sustratos y proteínas de cohortes depende del estado de ATP, como los GroEL/HSP60/Cpn60 o sistemas chaperona HSP90 14,15, o donde a cualquier otro sistema afinidades de unión son modulados por el ATP. Affinity modulación debería funcionar también para los casos en que las afinidades entre las interacciones proteína son alteradas por las drogas específicas, como radicicol o geldanamicina en el caso de los sistemas de HSP90 15. Una limitación clara de nuestro protocolo es que requiere purificado por afinidad anticuerpos contra una proteína diana conocida por ser sensible a un tratamiento específico / medicamento que modula su afinidad por las proteínas asociadas. Por lo tanto, no es de procedimiento de alto rendimiento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Proteína A Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> La tienda de desecado a -20 ° C, se disuelven directamente antes de usar </td></tr><tr><td> Inhibidor de la proteasa (completo, libre de EDTA) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> El fosfato de creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> La creatina fosfoquinasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Almacenar desecadas a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isótopo laboratorios, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinasa Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina perlas (tripsina inmovilizada Poroszyme) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mezclar vigorosamente directamente antes de usar </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm de discos </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Interacciones proteína-proteína son fundamentales para muchos procesos biológicos en la célula. Por lo tanto, su caracterización juega un papel importante en la investigación actual y una plétora de métodos para su investigación está disponible 1. Interacciones proteína-proteína a menudo son altamente dinámico y puede depender de la localización subcelular, modificaciones post-traduccionales y el medio ambiente local de proteínas 2. Por lo tanto, deben ser investigadas en su ambiente natural, para la cual co-inmunoprecipitación enfoques son el método de elección 3. Co-precipitados compañeros de interacción se identifican bien mediante inmunotransferencia en un enfoque específico, o por espectrometría de masas (LC-MS/MS) de una manera no selectiva. La última estrategia a menudo se ve afectada por un gran número de falsos positivos descubrimientos, deriva principalmente de la alta sensibilidad de los espectrómetros de masas modernos que confiadamente detectar trazas de proteínas inespecíficamente precipitantes. A recent enfoque para superar este problema se basa en la idea de que cantidades reducidas de compañeros de interacción específicos se co-precipitado con una proteína diana dada celular cuya concentración es reducida por RNAi, mientras que las cantidades de proteínas inespecíficamente precipitantes no debería verse afectada. Este enfoque, denominado RÁPIDA para inmunoprecipitación cuantitativo combinado con Knockdown 4, emplea etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) 5 y MS para cuantificar las cantidades de proteínas inmunoprecipitadas a partir de cepas de tipo salvaje y derribo. Proteínas que se encuentran en una proporción de 1:1 se puede considerar como contaminantes, aquellos enriquecidos en precipita de la de tipo salvaje como compañeros de interacción específicos de la proteína diana. Aunque innovadora, QUICK tiene algunas limitaciones: en primer lugar, SILAC es costosa y limitada para los organismos que idealmente son auxotróficos para arginina y / o lisina. Por otra parte, cuando la arginina pesada es alimentada, arginina-a-prolina resultados de interconversión en Additional masa se ​​desplaza por cada prolina en un péptido y un poco pesado diluye con arginina luz, lo que hace una cuantificación más precisa y menos tedioso 5,6. En segundo lugar, QUICK requiere que los anticuerpos se titulan de manera que no se sature con proteína diana en extractos de mutantes knock-down. Aquí presentamos un protocolo modificado rápida que supera las limitaciones antes mencionadas del RÁPIDA sustituyendo SILAC para el etiquetado 15 N metabólico y sustituyendo RNAi mediada por knock-down para la modulación de la afinidad de las interacciones proteína-proteína. Se demuestra la aplicabilidad de este protocolo utilizando los Chlamydomonas reinhardtii alga verde unicelular como organismo modelo y la chaperona hsp70B cloroplasto como proteína diana 7 (Figura 1). HSP70s se sabe que interactúan con determinados compañeros de chaperones y sustratos sólo en el estado ADP 8. Aprovechamos esta propiedad como un medio para verificar la específicainteracción de hsp70B con su factor de intercambio de nucleótidos CGE1 9.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa en<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcaje metabólico, la modulación de la afinidad de las interacciones proteína-proteína por la presencia / ausencia de ATP, la inmunoprecipitación, y espectrometría de masas cuantitativo.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa en 15N Marcaje metabólico, la modulación de la afinidad de las interacciones proteína-proteína por la presencia / ausencia de ATP, la inmunoprecipitación, y espectrometría de masas cuantitativo.

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