Biz CF1β karşı antiserum için Olivier Vallon ederim. Bu çalışma Max Planck Topluluğu ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (Sistem Biyolojisi Girişimi FORSYS, proje GoFORSYS) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Geçici protein-protein etkileşimleri (QUICK-X) yakalamak için bir çapraz adım ve eşitsiz çöktürme verimleri 6 normalleştirmek için bir kontrol Yağış: Biz son zamanlarda HIZLI anlayışın iki iyileştirmeler girmiştik. Burada HIZLI iki fazla iyileştirmeler içeren bir protokol mevcut: birincisi, biz 15 N metabolik etiketleme için SILAC 5 değiştirin. Avantajları 15 N basit inorganik tuz olarak sağlandığı takdirde 15 N metabolik etiketleme, SILAC daha ucuz olmasıdır. Bundan başka, 15 N metabolik etiketleme ile HIZLI birçok bitki, mantar ve bakteri gibi, tüm amino asitler için organizmalar Prototrofik için uygulanabilir. Ve nihayet, SILAC 5,6 doğasında arginin-to-prolin interconversion 15 N etiketli peptidler ölçümü için bir sorun teşkil etmiyor. 15 N proteomik verilerin nicel değerlendirmesi için uygun araçlar için örnekler MSQUANT 12 veya ben vardırOMIQS 13. İkinci olarak, özellikle bir karşı bir örnek olarak, belirli bir hedef proteinle etkileşime protein miktarını azaltmak için bir vasıta olarak yakınlık modülasyon tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, bir model sistemlerini oluşturmak için zor olan ya da tüm proteinler, elzem hedef durumunda üretilen edilemez devirme mutant inşasında circumvents olduğunu vardır. Ayrıca, potansiyel bir hedef protein yikiyor için hücre bir tepki olarak ortaya çıkan diferansiyel protein ekspresyonu neden yanlış yorumlamaları önler: diğer proteinlerin yanı aşağı-regüle ve immünopresipitasyon için kullanılan antiserum ile çapraz reaksiyona, onlar yorumlanır hedef proteinin gerçek etkileşim ortakları olarak. Son olarak, afinite modülasyon uygun bir antikor-antijen ile-bulma oranı olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. Biz model organizma olarak Chlamydomonas reinhardtii bizim protokol uygulanmasına rağmen, Kolayca hücre kültürü içinde yetiştirilen ve azot kaynağı olarak amonyum nitrat ya da kullanabilir edilebilir herhangi bir diğer organizma için adapte edilebilir. ATP / ADP protein komplekslerinin Affinity modülasyon doğrudan doğruya GroEL/HSP60/Cpn60 ya da HSP90 şaperon sistemleri 14,15 gibi olan etkileşimi ve kohort substrat proteinleri ile ATP durumuna göre değişir diğer şaperonlar uygulanabilir, ya da herhangi bir diğer sistem ile yer edilebilir bağlanma afiniteleri ATP tarafından modüle edilir. Afinite modülasyon aynı zamanda protein etkileşimi ile afiniteleri HSP90 sistemleri 15 söz konusu olduğunda radicicol veya geldanamycin gibi belirli ilaç ile değiştirilmiş olduğu durumlarda için çalışması gerekir. Bizim protokol açık bir sınırlama gerektirir olmasıdır afiniteyle saflaştırılmış özel bir tedavi / ortağı proteinleri olan yakınlığından modüle ilaca duyarlı olduğu bilinen bir hedef proteine ​​karşı antikorlar. Bu nedenle, herhangi bir yüksek hacimli bir yöntemdir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> -20 ° C&#39;de kurutulmuş Mağaza, kullanmadan önce doğrudan çözülür </td></tr><tr><td> (Tam, EDTA-ücretsiz) Proteaz inhibitörü </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenozin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatin fosfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatin fosfokinaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [süksinimidil propionat] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> 4 at kurutulmuş Mağaza ° C </td></tr><tr><td> 15 NH4CI </td><td> Cambridge izotop laboratuvarları, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin boncuklar (Poroszyme Tripsin İmmobilize) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Doğrudan kullanmadan önce kuvvetlice karıştırın </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-protein etkileşimleri hücrede birçok biyolojik süreçleri için temel vardır. Bu nedenle, karakterizasyonu araştırmalarını 1 mevcut olduğu için yöntemler mevcut araştırma ve bir bolluk önemli bir rol oynar. Protein-protein etkileşimleri genellikle son derece dinamik ve hücre içi lokalizasyonu, translasyon sonrası modifikasyonlar ve yerel proteini çevreye 2 bağlı olabilir. Bu nedenle, co-immünopresipitasyon yaklaşımlar tercih 3 yöntemi olduğu için, doğal ortamda araştırılması gerekmektedir. Co-Çökelen etkileşim ortakları bir hedeflenmemiş bir şekilde hedefe yönelik bir yaklaşım içinde, ya da kütle spektrofotometresi (LC-MS/MS) ile immünoblot yoluyla tespit edilir. Bu ikinci strateji genellikle olumsuz özellikle güvenli bir unspecifically tetikleyici proteinlerin izlerini tespit çağdaş kütle spektrometre ve yüksek hassasiyet elde edilen sahte pozitif buluşları, çok sayıda tarafından etkilenir. Bir recenBu sorunun üstesinden gelmek için t yaklaşım fikrine dayanır unspecifically tetikleyici protein miktarları etkilenmemiş olması gerekir, belli etkileşim ortak düşük miktarda hücresel konsantrasyon RNAi ile azaltılır, belirli bir hedef proteini ile ortak bir çökelti kalmayacaktır. Bu yaklaşım, Nakavt 4 ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon QUICK adlandırılan yabani tip ve knock-down suşları immunoprecipitated protein miktarları ölçmek için Kararlı İzotop Hücre kültüründe Amino asitlerin Etiketleme (SILAC) 5 ve MS kullanır. 1:1 oranında bulunan kirletici proteinler, hedef proteinin özel etkileşim ortağı olarak yabani tip çökelti içinde zenginleştirilmiş olan olarak kabul edilebilir. Yenilikçi, HIZLI bazı kısıtlamalar taşır rağmen: İlk, SILAC maliyet-yoğun ve ideal arjinin ve / veya lizin için okzotrofik olan organizmalar için sınırlıdır. Addit Bunun yanında, arginin, ağır besleme durumunda, arginin-to-prolin interconversion sonuçional kitlesel bir peptid her prolin için vardiya ve biraz miktar daha sıkıcı ve 5,6 daha az hassas hale ışık arginin, ağır sulandırır. İkincisi, HIZLI antikorlar onlar knock-down mutantlar özler hedef proteini ile doymuş hale gelmez böyle titre gerektirir. Burada 15 N metabolik etiketleme için SILAC değiştirerek ve protein-protein etkileşimleri afinite modülasyonu için RNAi-aracılı knock-down değiştirerek HIZLI ve yukarıda belirtilen sınırlamaları aşan bir modifiye HIZLI protokol tanıtmak. Biz tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas model organizma ve hedef protein 7 (Şekil 1) olarak kloroplast HSP70B eşlikçi olarak reinhardtii kullanarak bu protokolün uygulanabilirliğini göstermek. HSP70s özel ko-şaperonlar ve sadece ADP durum 8 yüzeyler ile etkileşim bilinmektedir. Bu özel kontrol etmek için bir araç olarak bu özellik faydalanmakonun nükleotid değişimi faktörü CGE1 9 ile HSP70B etkileşimi.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma dayanmaktadır<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolik etiketleme, ATP, immünopresipitasyon ve kantitatif kütle spektrometresi varlığı / yokluğu ile protein-protein etkileşimleri yakınlıklarından modülasyonu.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma dayanmaktadır 15N Metabolik etiketleme, ATP, immünopresipitasyon ve kantitatif kütle spektrometresi varlığı / yokluğu ile protein-protein etkileşimleri yakınlıklarından modülasyonu.

Video: A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation