Ringraziamo Olivier Vallon per l&#39;antisiero contro CF1β. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society e sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (la biologia dei sistemi FORSYS iniziativa, GoFORSYS progetto).

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo recentemente introdotto due miglioramenti del metodo VELOCE: una fase di reticolazione per catturare transitori interazioni proteina-proteina (QUICK-X), e la precipitazione di controllo di normalizzare l&#39;efficienza precipitazioni disuguali 6. Qui vi presentiamo un protocollo contenente due miglioramenti in più di RAPIDO: in primo luogo, si sostituisce SILAC 5 per 15 N marcatura metabolica. I vantaggi sono che 15 N marcatura metabolica è molto più economico rispetto SILAC, se 15 N viene fornito come semplice sale inorganico. Inoltre, con 15 N metabolica etichettatura RAPIDO può essere applicato a prototrofici organismi per tutti gli aminoacidi, come la maggior parte delle piante, funghi e batteri. E infine, arginina-to-prolina interconversione inerente SILAC 5,6 non rappresenta un problema per la quantificazione di 15 N peptidi marcati. Esempi di strumenti idonei per la valutazione quantitativa di 15 proteomica N dati sono 12 MSQUANT o IOMIQS 13. In secondo luogo, si introduce affinità modulazione come mezzo per specificatamente ridurre la quantità di proteine ​​che interagiscono con una proteina bersaglio in un dato campione rispetto all&#39;altro. I vantaggi di questo approccio sono che aggira la costruzione di mutanti knockdown, che per alcuni sistemi modello sono difficili da generare o non può essere generato affatto in caso di proteine ​​bersaglio essenziali. Inoltre, evita fraintendimenti dovuti espressione differenziale proteine ​​potenzialmente presenti come una risposta della cellula a bussare-giù una proteina bersaglio: se altre proteine ​​sono down-regolati come bene e cross-reagiscono con l&#39;antisiero utilizzato per immunoprecipitazione, verrebbero interpretati come partner vera interazione della proteina bersaglio. Finalmente, affinità modulazione sopprime la necessità di trovare un buon anticorpo antigene-to-rapporto. Anche se applichiamo il nostro protocollo di Chlamydomonas reinhardtii come organismo modello, Può essere facilmente adattato a qualsiasi altro organismo che può essere coltivata in coltura cellulare ed è in grado di utilizzare o nitrato di ammonio come fonte di azoto. Modulazione affinità di complessi proteici da ATP / ADP può essere direttamente applicato ad altri accompagnatori cui interazione con i substrati e proteine ​​coorte dipende dallo stato ATP, come i sistemi GroEL/HSP60/Cpn60 o HSP90 chaperone 14,15, o qualsiasi altro sistema in cui affinità di legame sono modulate da ATP. Affinità modulazione dovrebbe funzionare anche per i casi in cui sono alterati affinità tra le interazioni proteina da farmaci specifici, come radicicol geldanamicina o nel caso di sistemi Hsp90 15. Un limite evidente di questo protocollo è che richiede purificati per affinità di anticorpi contro una proteina bersaglio noto per essere sensibili ad un trattamento specifico / farmaco che modula la sua affinità per le proteine ​​partner. Pertanto, non è elevato throughput metodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Proteina Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Conservare essiccato a -20 ° C, sciogliere direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi (completo, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenosina-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatina fosfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfochinasi creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Conservare essiccato a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotopo laboratori, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinasi Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina perline (Poroszyme Immobilized tripsina) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mescolare energicamente direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 millimetri disco </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Interazioni proteina-proteina sono fondamentali per molti processi biologici nella cellula. Pertanto, la loro caratterizzazione svolge un ruolo importante nella ricerca attuale e una pletora di metodi per la loro indagine è disponibile 1. Interazioni proteina-proteina sono spesso altamente dinamico e potrebbe dipendere localizzazione subcellulare, modificazioni post-traduzionali di proteine ​​e dell&#39;ambiente locale 2. Pertanto, essi devono essere esaminati nel loro ambiente naturale, per cui co-immunoprecipitazione approcci sono il metodo di scelta 3. Co-precipitate partner di interazione sono identificati mediante immunoblotting in un approccio mirato, o spettrometria di massa (LC-MS/MS) in modo non mirati. Quest&#39;ultima strategia spesso è influenzata negativamente da un gran numero di falsi positivi scoperte, derivano principalmente dalla sensibilità di moderni spettrometri di massa che con sicurezza rilevare tracce di aspecifico proteine ​​precipitanti. A Recent approccio per superare questo problema si basa sull&#39;idea che ridotte quantità di partner di interazione specifici sarà co-precipitato con una proteina bersaglio in cui la concentrazione cellulare è diminuito di RNAi, mentre le quantità di proteine ​​aspecifico precipitanti dovrebbe essere influenzata. Questo approccio, chiamato VELOCE per immunoprecipitazione quantitativi combinazione con atterramento 4, impiega Etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) 5 e MS per quantificare la quantità di proteine ​​immunoprecipitate da ceppi wild-type e knock-down. Proteine ​​che si trovano in un rapporto di 1:1 può essere considerata come contaminanti, tali arricchito in precipitati dal tipo selvaggio come partner di interazione specifici della proteina bersaglio. Anche se innovativo, QUICK porta alcune limitazioni: in primo luogo, SILAC è costosa e limitata per gli organismi che idealmente sono auxotrophic per arginina e / o lisina. Risultati di interconversione Inoltre, quando viene alimentato arginina pesante, arginina-to-prolina in additmassa ional sposta per ciascun prolina in un peptide e diluisce leggermente pesante con arginina luce, che rende la quantificazione più noioso e meno accurato 5,6. Secondo, VELOCE richiede che gli anticorpi vengono titolati in modo tale che essi non si satura con proteina bersaglio in estratti di knock-down mutanti. Qui vi presentiamo un protocollo modificato VELOCE che supera i limiti di cui sopra, con Quick sostituendo SILAC per l&#39;etichettatura 15 N metabolica e sostituendo RNAi mediato knock-down per la modulazione affinità di interazioni proteina-proteina. Dimostriamo l&#39;applicabilità del protocollo in base alle unicellulari Chlamydomonas verde alga reinhardtii come organismo modello e il tuttofare HSP70B cloroplasto come proteina bersaglio 7 (Figura 1). HSP70s sono noti per interagire con specifiche co-accompagnatori e substrati solo nello stato ADP 8. Sfruttiamo questa proprietà come mezzo per verificare la specificainterazione di HSP70B con il suo fattore di scambio nucleotidico CGE1 9.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato sulla<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcatura metabolica, la modulazione di affinità di interazioni proteina-proteina dalla presenza / assenza di ATP, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K Views.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato sulla 15N Marcatura metabolica, la modulazione di affinità di interazioni proteina-proteina dalla presenza / assenza di ATP, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa.

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