Nous tenons à remercier Olivier Vallon pour l&#39;antisérum contre CF1β. Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck et des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (biologie des systèmes Forsys Initiative, GoFORSYS projet).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons récemment introduit deux améliorations à l&#39;approche RAPIDE: une étape de réticulation pour la capture transitoires interactions protéine-protéine (QUICK-X), et une précipitation de contrôle pour normaliser les efficacités des précipitations inégales 6. Nous présentons ici un protocole contenant deux autres améliorations de QUICK: tout d&#39;abord, nous remplaçons SILAC 5 pour 15 N marquage métabolique. Les avantages sont que 15 N marquage métabolique est beaucoup moins cher que SILAC, si 15 N est fourni sous forme de sel inorganique simple. En outre, avec 15 N métabolique étiquetage RAPIDE peut être appliqué à des organismes prototrophes pour tous les acides aminés, comme la plupart des plantes, les champignons et les bactéries. Et enfin, l&#39;arginine-à-proline interconversion inhérent à 5,6 SILAC ne pose pas de problème pour la quantification de 15 N peptides marqués. Exemples d&#39;outils appropriés pour l&#39;évaluation quantitative de la protéomique N 15 données sont 12 MSQUANT ou jeOMIQS 13. Deuxièmement, on introduit une modulation d&#39;affinité en tant que moyen pour réduire spécifiquement la quantité de protéines qui interagissent avec une protéine cible dans un échantillon donné par rapport à l&#39;autre. Les avantages de cette approche est qu&#39;elle contourne la construction de mutants knock-down, qui, pour certains systèmes modèles sont difficiles à produire ou ne peut pas être généré du tout dans le cas de protéines cibles essentielles. En outre, elle permet d&#39;éviter des interprétations erronées causées par l&#39;expression différentielle des protéines potentiellement se produisant en réponse à la cellule de frappe vers le bas d&#39;une protéine cible: si d&#39;autres protéines sont régulés à la baisse et ainsi une réaction croisée avec l&#39;antisérum utilisé pour l&#39;immunoprécipitation, ils sont interprétés comme de véritables partenaires d&#39;interaction de la protéine cible. Enfin, l&#39;affinité de modulation supprime la nécessité de trouver un bon anticorps-antigène au rapport. Bien que nous appliquons notre protocole de Chlamydomonas reinhardtii comme organisme modèle, Il peut facilement être adapté à tout autre organisme qui peut être cultivée en culture cellulaire et est capable d&#39;utiliser d&#39;ammonium ou de nitrate comme source d&#39;azote. Modulation de l&#39;affinité des complexes protéiques par l&#39;ATP / ADP peut être directement appliquée à d&#39;autres chaperons dont l&#39;interaction avec des substrats et des protéines de cohorte dépend de l&#39;état ATP, comme les GroEL/HSP60/Cpn60 ou HSP90 systèmes chaperon 14,15, ou à tout autre système où affinités de liaison sont modulés par l&#39;ATP. Affinity modulation devrait aussi fonctionner pour les cas où les affinités entre les interactions entre protéines sont altérés par des médicaments spécifiques, comme la geldanamycine radicicol ou dans le cas de systèmes de HSP90 15. Une limitation claire de notre protocole est qu&#39;il nécessite purifié par affinité des anticorps dirigés contre une protéine cible connue pour être sensible à un traitement spécifique / médicament qui module son affinité pour les protéines partenaires. Par conséquent, il n&#39;existe pas de méthode à haut débit.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Proteína Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (diméthyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Stockez desséchée à -20 ° C, se dissolvent directement avant utilisation </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase (complet, sans EDTA) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adénosine-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> La créatine phosphate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Créatine phosphokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP dithiobis [succinimidyl propionate] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Stockez desséchée à 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoprotéinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Perles trypsine (trypsine immobilisée Poroszyme) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mélanger vigoureusement juste avant d&#39;utiliser </td></tr><tr><td> Disque Empore mm 18 C 47 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Interactions protéine-protéine sont fondamentales pour de nombreux processus biologiques dans la cellule. Par conséquent, leur caractérisation joue un rôle important dans la recherche actuelle et une multitude de méthodes pour leur enquête est disponible 1. Interactions protéine-protéine sont souvent hautement dynamique et peut dépendre de la localisation subcellulaire, modifications post-traductionnelles des protéines et de l&#39;environnement local 2. Par conséquent, ils devraient être étudiés dans leur environnement naturel, pour lesquels les approches de co-immunoprécipitation sont la méthode de choix 3. Partenaires d&#39;interaction co-précipités sont identifiés soit par immunoblot dans une approche ciblée, ou par spectrométrie de masse (LC-MS/MS) d&#39;une manière non ciblée. Cette dernière stratégie est souvent affectée par un grand nombre de fausses découvertes positives, provient principalement de la forte sensibilité des spectromètres de masse modernes confiance détecter des traces de protéines précipitant non spécifique. Un recent approche pour résoudre ce problème est basée sur l&#39;idée que des quantités réduites de partenaires d&#39;interaction spécifiques sera co-précipité avec une protéine cible donnée dont la concentration cellulaire est réduite par l&#39;ARNi, tandis que les quantités de protéines non spécifique de précipitation devraient pas être affectés. Cette approche, appelée RAPIDE pour immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown 4, emploie étiquetage des isotopes stables d&#39;acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) 5 et MS pour quantifier les quantités de protéines immunoprécipitées à partir de souches de type sauvage et knock-down. Protéines présentes dans un rapport de 1:1 peut être considéré comme contaminants, enrichie en ces précipités du type sauvage comme partenaires d&#39;interaction spécifique de la protéine cible. Bien que novateur, QUICK porte certaines limites: d&#39;une part, SILAC est très coûteux et limité pour les organismes qui, idéalement, sont auxotrophes pour l&#39;arginine et / ou la lysine. Des résultats d&#39;interconversion De plus, lorsque l&#39;arginine lourde est alimenté, l&#39;arginine-à-proline dans additional de masse se déplace pour chaque proline dans un peptide et dilue un peu lourd avec de l&#39;arginine lumière, ce qui en fait une quantification plus fastidieux et moins précis 5,6. D&#39;autre part, RAPIDE nécessite que des anticorps sont titrés de manière à ne pas se saturer avec la protéine cible dans des extraits de mutants knock-down. Ici, nous introduisons un protocole modifié QUICK qui surmonte les limitations mentionnées ci-dessus en remplaçant de QUICK SILAC pour l&#39;étiquetage 15 N métabolique et en remplaçant l&#39;ARNi médiée par le knock-down pour la modulation de l&#39;affinité interactions protéine-protéine. Nous démontrons l&#39;applicabilité de ce protocole en utilisant les algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii comme organisme modèle et le chaperon hsp70B chloroplaste de 7 protéine cible (figure 1). HSP70s sont connus pour interagir avec certains co-chaperons et des substrats que dans l&#39;état ADP 8. Nous exploitons cette propriété comme un moyen de vérifier le spécifiqueinteraction de hsp70B avec son facteur d&#39;échange des nucléotides CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Nous présentons une variante de l&#39;RAPIDE (immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown) approche qui a déjà été introduite pour distinguer entre les vraies et les fausses interactions protéine-protéine. Notre approche est basée sur<sup&gt; 15N</sup&gt; Marquage métabolique, la modulation des affinités interactions protéine-protéine par la présence / absence d&#39;ATP, immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K vues.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Nous présentons une variante de l'RAPIDE (immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown) approche qui a déjà été introduite pour distinguer entre les vraies et les fausses interactions protéine-protéine. Notre approche est basée sur 15N Marquage métabolique, la modulation des affinités interactions protéine-protéine par la présence / absence d'ATP, immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative.

Vidéo: A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation