Agradecemos Olivier Vallon para o anti-soro contra CF1β. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (Forsys Biologia de Sistemas, GoFORSYS iniciativa do projeto).

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Introduzimos recentemente duas melhorias para a abordagem rápida: um passo para a captura de reticulação transitórios interações proteína-proteína (Quick-X), e uma precipitação de controle para normalizar a eficiência de precipitação desiguais 6. Aqui apresentamos um protocolo contendo duas melhorias mais de RÁPIDO: primeiro, substituir SILAC 5 para 15 N marcação metabólica. As vantagens são que 15 N marcação metabólica é muito mais barato do que SILAC, se 15 N é fornecida como sal inorgânico simples. Além disso, com 15 N metabólica rotulagem QUICK pode ser aplicado a prototrófica organismos para todos os aminoácidos, como a maioria das plantas, fungos e bactérias. E, finalmente, a arginina-prolina interconversão inerente ao SILAC 5,6 não apresenta um problema para a quantificação de 15 N rotulado peptídeos. Exemplos de instrumentos adequados para a avaliação quantitativa da proteômica 15 N são dados 12 MSQUANT ou euOMIQS 13. Em segundo lugar, introduz-se a afinidade de modulação como um meio para reduzir especificamente a quantidade de proteínas que interagem com uma proteína alvo em uma amostra dada em relação a outro. As vantagens desta abordagem são que contorna a construção de mutantes de knockdown, que para alguns sistemas modelo são difíceis de gerar ou não pode ser gerada em tudo, no caso de proteínas-alvo essenciais. Além disso, evita-se interpretações causadas pela expressão diferencial de proteínas potencialmente ocorrer como uma resposta da célula a bater para baixo uma proteína alvo: se outras proteínas são reprimidos bem e reagem de forma cruzada com o anti-soro utilizado para a imunoprecipitação, que seria interpretada como parceiros de interacção verdadeiros da proteína alvo. Por fim, a afinidade de modulação elimina a necessidade de se encontrar uma proporção de anticorpo para o antigénio-apropriada. Apesar de aplicar o nosso protocolo para Chlamydomonas reinhardtii como organismo modelo, Ele pode ser facilmente adaptado a qualquer outro organismo que pode ser cultivada em cultura de células e é capaz de utilizar de amónio ou nitrato como fonte de azoto. Afinidade modulação de complexos de proteínas por ATP / ADP pode ser directamente aplicada a outros chaperones cuja interacção com substratos e proteínas coorte depende do estado de ATP, tal como os sistemas de HSP90 GroEL/HSP60/Cpn60 ou chaperones 14,15, ou a qualquer outro sistema em que afinidades de ligação são modulados por ATP. Afinidade modulação deve funcionar também para os casos em que as afinidades entre interacções proteicas são alterados por drogas específicas, como radicicol geldanamicina ou, no caso de sistemas de Hsp90 15. Uma limitação clara do nosso protocolo é que ele requer purificados por afinidade de anticorpos contra uma proteína alvo conhecida para ser sensíveis a um tratamento específico / droga que modula a sua afinidade para as proteínas parceiras. Portanto, há um método de alto rendimento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Proteína Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Armazenar dessecado a -20 ° C, dissolvem-se directamente antes da utilização </td></tr><tr><td> Inibidor da protease (completo, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenosina-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> O fosfato de creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinafosfoquinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> Armazenar dessecado a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de tripsina (tripsina imobilizada Poroszyme) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Misture vigorosamente diretamente antes de usar </td></tr><tr><td> Empore Disk mm C 18 47 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Interacções proteína-proteína são fundamentais para muitos processos biológicos na célula. Portanto, a sua caracterização desempenha um papel importante na investigação actual e de uma pletora de métodos para a sua investigação é disponível 1. Interacções proteína-proteína são muitas vezes altamente dinâmico e pode depender da localização subcelular, modificações pós-tradução da proteína e do ambiente local 2. Por isso, devem ser investigados no seu ambiente natural, para a qual co-imunoprecipitação abordagens são o método de escolha 3. Parceiros de co-precipitados de interacção são identificados quer por imunotransferência em uma abordagem orientada, ou por espectrometria de massa (LC-MS/MS) de uma forma não segmentados. A última estratégia muitas vezes é negativamente afetada por um grande número de falsos positivos descobertas, principalmente derivada da alta sensibilidade dos espectrômetros de massa modernas que confiantemente detectar vestígios de proteínas não específica precipitantes. A Recent abordagem para ultrapassar este problema é baseada na ideia de que quantidades reduzidas de parceiros específicos de interacção irá co-precipitado com uma dada proteína alvo, cuja concentração celular é reduzido por RNAi, enquanto as quantidades de proteínas não específica, não deve ser afectada precipitantes. Esta abordagem, chamada QUICK por imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown 4, emprega Labeling isótopo estável de Aminoácidos em cultura celular (SILAC) 5 e MS para quantificar as quantidades de proteínas imunoprecipitadas a partir de estirpes do tipo selvagem e knock-down. Proteínas encontradas em uma proporção de 1:1 podem ser considerados como contaminantes, aqueles enriquecidos em precipitados a partir do tipo selvagem, como parceiros específicos de interacção da proteína alvo. Embora inovador, QUICK possui algumas limitações: em primeiro lugar, é SILAC custo intensivo e limitado para os organismos que, idealmente, são auxotróficas para arginina e / ou lisina. Além disso, quando a arginina pesado é alimentada, a arginina-to-proline resultados de interconversão em additmassa ional desloca para cada prolina num péptido e dilui ligeiramente pesado com arginina luz, o que faz com que a quantificação mais tediosa e menos precisa 5,6. Em segundo lugar, QUICK requer que os anticorpos são titulados de tal forma que eles não se tornam saturado com a proteína alvo em extractos de knock-down mutantes. Aqui, apresentamos um protocolo modificado rápido que supera as limitações acima referidas do QUICK substituindo SILAC para a rotulagem 15 N metabólica e pela substituição de RNAi mediada por knock-down para afinidade modulação de interações proteína-proteína. Nós demonstrar a aplicabilidade do presente protocolo utilizando as unicelulares Chlamydomonas reinhardtii alga verde como organismo-modelo e o acompanhante HSP70B cloroplasto como proteína alvo 7 (Figura 1). HSP70s são conhecidos por interagir com determinados colegas de acompanhantes e substratos apenas no estado ADP 8. Nós explorar essa propriedade como um meio de verificar a específicainteração de HSP70B com seu fator de troca de nucleotídeos CGE1 9.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é baseada<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcação metabólica, a modulação da afinidade das interacções proteína-proteína com a presença / ausência de ATP, imunoprecipitação, e por espectrometria de massa quantitativo.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

20.3K visualizações.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é baseada 15N Marcação metabólica, a modulação da afinidade das interacções proteína-proteína com a presença / ausência de ATP, imunoprecipitação, e por espectrometria de massa quantitativo.

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