Damos las gracias a los miembros del laboratorio Mariani ayuda editando el protocolo. Este trabajo fue financiado por el CIRM Formación Postdoctoral Grant (JLF), un internado CIRM BRIDGES (TZTT), el Robert E. May y R. Wright Foundation (FVM) y la Universidad del Sur de California (FVM).

1. LysoTracker tinción de embriones de ratón <ol><li> Generar embriones de ratón mediante la colocación de jóvenes (5-6 semanas de edad) las hembras en jaulas de prisioneros masculinos. Monitorear la mañana siguiente para la aparición de un tapón vaginal que indica que se ha producido el apareamiento. Si la mujer está embarazada, el mediodía de ese día se llama 0,5 dpc (coito días después). El procedimiento que aquí se presenta es ideal para los embriones 13.7 dpc. </li><li> En el día embrionario de interés, la eutanasia a la hembra de acuerdo con los protocolos aprobados y quitar el útero. Retire los embriones de la decidua en una placa de Petri de 10 cm con Hanks BSS (sin rojo fenol). Retire las membranas extra-embrionarias y que por lo menos un enjuague con Hanks BSS para eliminar los tejidos extraños y sangre. </li><li> Preparar embriones LysoTracker solución de tinción (5 mM en LysoTracker Hanks BSS). Un volumen conveniente para 1-2 camadas es de 5 ml. Mezclar suavemente para desembolsar el colorante uniformemente. </li><li> Añadir embriones al Solut LysoTracker tinción de embrionesiones en un tubo de microcentrífuga o vial y se incuba a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Enjuague suavemente en Hanks BSS cuatro veces, 5 minutos cada lavado. </li><li> Fijar en 4% paraformaldehido durante la noche. </li><li> Enjuagar una vez en Hanks BSS, 10 min, para eliminar la solución. </li><li> Deshidratar a través de una serie metanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min cada paso) para eliminar la tinción de fondo. Esto es importante para lograr una buena relación señal a ruido durante la exploración. </li><li> En este punto usted puede almacenar las muestras de embriones indefinidamente en metanol a -20 ° C, protegido de la luz. </li></ol> Nota: Una muestra de tejido se pueden tomar en cualquier paso para el genotipado de ADN, sin embargo, puede ser más conveniente para tomar una muestra justo antes del almacenamiento de modo que hasta esta etapa todas las muestras pueden ser procesadas por lotes. Se recoge una muestra de tejido de la cola, extremidad, o la cabeza de cada embrión y poner todo en tubos separados. Rehidratar la muestra de tejido y se preparan para genotyping. 2. LysoTracker tinción de diferenciación de las Culturas ES <ol><li> Preparar cuerpos embrioides a través del Método de la gota colgante 15 con una densidad inicial de 500 células por 20 l gota. </li><li> Después de 3 días, la transferencia de los cuerpos embrioides al cultivo en suspensión en 10 cm no adherentes placas de Petri (es decir, los que se utilizan para el trabajo bacteriológico). Cultura durante 5 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2 días. </li><li> El día 7, trasladar los cuerpos embrioides a gelatinizados portaobjetos de cámara de 8 pocillos (añadir un 0,1% de gelatina a las cámaras, espere 5 minutos, retirar y agregar los medios de comunicación). Traslado 1-2 cuerpos embrioides por cámara. </li><li> Cultura durante 10 días, el cambio de los medios de comunicación todos los días. Tener cuidado para colocar la pipeta en la esquina de la cámara de corredera a fin de no perturbar el cuerpo embrioide unir a la superficie del vidrio. También cuando la adición de medio fresco también colocar la pipeta en la esquina de la cámara y soltar los medios de comunicación lentamente. </li><li> Después de 10 días de cultoUre, para inducir la apoptosis como un control positivo, el tratamiento de algunos de los pocillos con 0,1 mM y 1,0 mM H 2 O 2 (añadir el H 2 O 2 a los medios de comunicación fresca, mezcla, a continuación, añadir a las células) durante 60 min. Aclarar dos veces con D-PBS y cultivo de una noche en medios regulares. </li><li> Aspirar suavemente medios de comunicación existentes y añadir la célula LysoTracker solución de tinción (500 LysoTracker nM (concentración final) en los medios de comunicación, 300 l por cámara). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Aclarar dos veces con D-PBS 2 veces, 5 min cada uno. </li><li> Fijar en 4% de paraformaldehído durante 15 min a TA. </li><li> Aclarar dos veces con D-PBS, 5 min. </li></ol> 3. Viendo embriones LysoTracker manchadas o culturas ES <ol><li> Preparar las muestras de células para la microscopía por aspiración de la D-PBS; retirar la cámara del portaobjetos; secar al aire durante aproximadamente 5 min, y luego la adición de un medio acuoso de montaje (Vectashield con DAPI o similar). Coloque una lámina de barrera mientras drying para disminuir blanqueo del fluoróforo. Montar los embriones en un recipiente hondo de cristal-depresión o pequeña placa de Petri en Vectashield o similar. </li><li> Visualizar con un microscopio de disección o compuesto equipado con una rodamina o Texas Red filtro (LysoTracker RED DND-99, de excitación / emisión: 577/590 nm). La coloración suele ser bastante brillante para exposiciones largas no son necesarias. </li></ol> 4. Cuantificación de los resultados mediante técnicas de imagen <ol><li> Toma fotos digitales de sus muestras bajo iguales condiciones de exposición en modo manual. </li><li> Abra las imágenes en Adobe Photoshop o un programa de imagen similar. Para determinar la cantidad de manchas LysoTracker, seleccionar el canal rojo y el umbral de la imagen (la imagen se convierte a negro y blanco) de tal manera que la tinción con rojo ahora es representado por píxeles blancos. Seleccione los píxeles blancos y usar la función de histograma para obtener el recuento total. </li><li> Utilice el canal azul para contarel número de núcleos en el campo. Puede ser útil llevar un registro de la cantidad de anotaciones en la imagen. </li><li> Registre los valores y luego calcular el nivel promedio por tinción celular. Repita este análisis con el umbral mismo para todas las imágenes que desea probar. </li></ol> 5. Los resultados representativos No hay un patrón normal de PCD durante el desarrollo embrionario que puede cambiar cuando un gen del factor de crecimiento, tales como Sonic hedgehog (Shh), se retira 16,17. Desde LysoTracker es un colorante de molécula pequeña que es altamente difusible, el embrión puede ser visualizado para evaluar las áreas de PCD incluso profundamente dentro del mesénquima 12,13 La Figura 1 muestra el patrón de tinción para LysoTracker normales y Shh -. / - Embriones de ratones mutantes en 10.5dpc. En esta etapa, la PCD se ve incrementado para Shh - / - embriones mutantes, en particular en la extremidad y regio somitens. Las porciones del embrión puede ser reflejado en todo el montaje a mayor aumento (1B) para evaluar el patrón general. Partes disecadas también pueden ser seccionados con un micrótomo vibrante (1C) o un criostato (DF) para revelar las regiones de PCD en mayor detalle. TUNEL análisis se realiza mejor en las secciones delgadas, donde la penetración de la transferasa terminal es menos problemática. Tinción LysoTracker y un ensayo de TUNEL se puede hacer en el mismo tejido (Figura 1D-G). Estos resultados muestran que, aunque no hay una estricta correlación 1:1 entre LysoTracker y tinción de TUNEL, las regiones generales de superposición PCD considerablemente. Con un aumento mayor, es posible ver que puncta tinción positiva con el ensayo de TUNEL, pero no con el colorante LysoTracker, puncta que mancha sólo con el colorante LysoTracker, y puncta que tienen la superposición de tinción. Cuando una EB se sembraron sobre una superficie recubierta con gelatina, células diferenciadoras se migrate hacia afuera. Después de 10 días de cultivo, las células se han diferenciado en una variedad de tipos de células incluyendo neuronas, células musculares, y cardiomiocitos. Los cultivos que se muestran en la Figura 2 contienen poblaciones mixtas de estos tipos de células, sin embargo se podría adaptar el protocolo para estudiar PCD de un tipo particular de célula de interés. Por ejemplo, el EB podrían ser tratados con ácido retinoico para mejorar la diferenciación de las neuronas 19, y luego el ensayo de LysoTracker podría ser utilizado para evaluar la muerte celular neuronal en condiciones diferentes. En la cultura normal de las células madre embrionarias diferenciadas, hay unas pocas células que se someten a PCD y estos pueden ser detectados con LysoTracker y / o ensayos de TUNEL (Figura 2A). PCD puede ser inducida por un número de diferentes agentes citotóxicos tales como peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) que induce daño oxidativo e inicia la ruta apoptótica 20,21. Una dosis baja de H 2 O 2 aumenta tantoLysoTracker y tinción TUNEL en comparación con ningún tratamiento, mientras que se produce una alta dosis de contracción celular y LysoTracker generalizada y la positividad TUNEL. Similar a los resultados en el embrión, es posible ver puncta que la tinción positiva con el ensayo de TUNEL, pero no con el colorante LysoTracker, puncta que se tiñen solamente con el colorante LysoTracker, y puncta que tienen la superposición de tinción. La consecuencia de la aplicación de un agente citotóxico que induce apopotosis se compara con las condiciones de privación de suero que inducen la autofagia (Figura 2D). Las células que se han sometido a un periodo de privación de suero (1 hora) presentan un patrón diferente donde LysoTracker y tinción TUNEL no se correlacionan altamente. Tinción LysoTracker es mucho mayor en comparación con los cultivos sin tratar, sin embargo positividad TUNEL se encuentra a niveles normales. El empleo de herramientas estándar disponibles en Adobe Photoshop, tinción LysoTracker se puede cuantificar con un método de umbral simpleque permite calcular el nivel de tinción promedio de una población de células. Figura 3A-B muestra cómo se ve una imagen de muestra durante el proceso de cuantificación. A partir de una imagen de referencia con la tinción de LysoTracker en el canal rojo y los núcleos con DAPI-manchado en el canal azul (panel 3A), el canal rojo de esta imagen fue thresholded para convertir la imagen en negro y blanco y los píxeles blancos eran seleccionan entonces y se contaron (Figura 3A &#39;). A nivel de umbral fue elegido que representa el patrón de tinción LysoTracker. Al igual que con cualquier método de cuantificación que utiliza imágenes, es importante evitar la sobreexposición de sus fotos ya que esto podría resultar en un excesivo énfasis en las diferencias. El número de los núcleos en el campo, entonces se puede contar al ver sólo el canal azul (Figura 3B) y el marcado de los núcleos utilizando una herramienta de dibujo tal como un pincel mientras cuenta (Figura 3B &#39;). Entonces se puede expresar the nivel de tinción mediante el cálculo del nivel medio de la tinción por célula (número de píxeles / Número de núcleos). Si se desea utilizar este algoritmo para alta producción, para la detección, la mayoría de los paquetes de detección pueden medir el brillo en un canal en particular y también tienen una función de identificador de objeto que se cuentan los núcleos en un campo, sin embargo para la mayoría de las aplicaciones típicas, el método manual es rápida y simple. Para dar un ejemplo, una región de la muestra en las Figuras 2A-C se cuantificó y confirmar los resultados que el aumento de las concentraciones de H 2 O 2 resultados en un nivel más alto de tinción LysoTracker (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. LysoTracker tinción normales y Shh - Embriones - /. A, A &#39;normales y Shh -. / - Embriones de ratón en 10,5 dpc, se tiñeron con Rojo LysoTracker, montado en Vectashield y se fotografiaron bajoepiflourescence un microscopio de disección. Los paréntesis indican la localización de las extremidades anteriores B, B &#39;extremidad anterior de normales y Shh -.. / - Embriones fotografiado a mayor aumento. Tenga en cuenta los dominios normales de muerte celular, incluyendo la &quot;zona posterior necrótica &#39;(marcado con un asterisco) y una región proximal en el mesénquima del primordio de la extremidad (marcada con una flecha). Extremidades Shh nulos muestran fuerte tinción en la porción medial y distal . c, c &#39;. secciones medial a través de la yema extremidad anterior de yemas de las extremidades normales y null. Obsérvese la presencia de tinción en el mesénquima proximal (flecha) y ARE (punta de flecha) de la yema de la extremidad normal y la fuerte tinción en el mesénquima dorsal y ventral y distal dentro de la yema del miembro nulo. DF. La misma sección (12 micras, congelados sección) fue fotografiada por LysoTracker y tinción TUNEL (Roche 1.684.795). La sección pasa a través de la porción distal de la mesenc Shh nuloHyme. Los puntos de punta de flecha a la AER. Nótese cómo el patrón general es muy similar con ambos métodos, sin embargo, la tinción no se superponen completamente. G, G &#39;. Con un aumento mayor de la ARE y el mesénquima, uno puede ver tanto la presencia de puntos lagrimales que son LysoTracker o TUNEL positiva sólo así como puntos lagrimales que se solapan las manchas. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. LysoTracker tinción en las células ES diferenciadas. Diferenciación de las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 8-en ausencia de LIF. Para mostrar cómo LysoTracker y comparar la tinción de TUNEL, la vía de la apoptosis fue inducida con 2 dosis diferentes de H 2 O 2, mientras que la vía de la autofagia se indujo usando 1 hora de privación de suero. Estas imágenes fueron tomadas con un Microscopio Confocal Zeiss LSM5 A-A&#39;&#39;:. Cultivos no tratados muestran algunos apoptosis normal como se indica por LysoTRacker y la tinción de TUNEL. El patrón de uso de ambas técnicas en su mayoría de solapamiento (flechas blancas), sin embargo, se puede ver un puncta pocos que son Lysotracker (flechas rojas) positivos sólo B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. Tratamiento con cantidades crecientes de H 2 O 2 estimula la apoptosis . La dosis inferior muestra más LysoTracker y puncta TUNEL positivo en comparación con las células no tratadas. La dosis más alta induce en LysoTracker aún más y puncta TUNEL positiva. flechas apuntan a las manchas White solapamiento, mientras que las flechas rojas apuntan a puncta que son positivos para LysoTracker sólo. También es posible ver puncta que sólo son positivas para la tinción de TUNEL (flechas verdes) DD &quot;:. privación de suero puede inducir la autofagia, que puede estimular una acumulación de material en los lisosomas y los autophagolysosomes. Tenga en cuenta cuántos puntos lagrimales LysoTracker son visibles en comparación con cultivos no tratados. TUNEL positiva puncta están presentes (la mayoría de ellas se solapan LysoTracker manchaING, flechas blancas), sin embargo, el número no es mucho mayor en comparación con condiciones sin tratamiento. Además, en condiciones de privación de suero, LysoTracker de sólo puncta positivo tienen una alta prevalencia (flechas rojas). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Método de cuantificación para evaluar el nivel de tinción en una población de células usando Adobe Photoshop. A: Una porción de la Figura 2A se ha elegido y la LysoTracker (canal rojo) y tinción con DAPI (núcleos, azul canal) se muestra en este panel &#39;A:. El canal rojo de la Figura 3A se thresholded para convertirlo en una y negro imagen en blanco. Los píxeles blancos pueden ser seleccionadas y se contaron utilizando la función de histograma B-B &#39;:. El canal azul muestra los núcleos y mientras contando, la imagen puede ser anotado con una función de dibujo tal como un pincel C:. Este es un excuantificación amplio de una muestra a partir de paneles 2A-C. Los datos se representan como píxeles por núcleos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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No hay conflictos de interés declarado.

Características importantes de la apoptosis incluyen la detección de daños en el ADN con el ensayo TUNEL, junto con la detección de la actividad caspasa (detectada con mAbs o una molécula de unión tal como zVAD-fmk), la observación de los cambios celulares, y la presentación de la fosfatidilserina (PS ) en la superficie de la membrana (detectado por Anexina V vinculante). Hay algunas desventajas con cada uno de estos ensayos. Por ejemplo, la transferasa terminal utilizado en el ensayo de TUNEL no penetra más al...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td></td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> LysoTracker Red NOM-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VECTOR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 CV- </td><td></td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> Cellgro </td><td> 25 a 025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Cellgro </td><td> 25 a 000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-mercaptoetanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> Labtek-II de la Cámara portaobjetos (8-bien) </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1% de gelatina </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Recetas de Soluciones 4% de paraformaldehído Para 100 ml: <ol><li> Mezclar 4 g de paraformaldehído, 90 ml de H 2 O, y NaOH (una gota de NaOH 2 N). El paraformaldehído no se disolverá hasta que haya añadido algún NaOH para aumentar el pH. </li><li> Se agita y se calienta a 60 ° C hasta que todo el polvo está en solución (~ 10-20 min). No sobrecaliente. </li><li> Añadir ~ 10 ml 10x PBS para obtener un volumen final de 100 ml. </li><li> Almacenar a -20 ° C en conveniente (~ 10 ml o 40 ml) ~ alícuotas. </li></ol> ADVERTENCIA: paraformaldehído en &#39;volante&#39; forma (pequeños gránulos comprimidos) es menor en polvo y por lo tanto puede ser medido fuera de una campana. Sin embargo, usted todavía debe usar una máscara protectora contra el polvo (N95por lo menos) durante la manipulación. EB Cultura Medios Para 500 ml de medio EB: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol: </td><td> 500l </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

La muerte celular programada (PCD) se produce en adultos para mantener la homeostasis del tejido normal y durante el desarrollo embrionario para dar forma a los tejidos y órganos 1,2,6,7. Durante el desarrollo, los productos químicos tóxicos o alteraciones genéticas pueden causar un aumento en la PCD o cambiar los patrones resultantes de PCD en anomalías en el desarrollo y defectos de nacimiento 3-5. Para entender la etiología de estos defectos, el estudio de los embriones puede complementarse con ensayos in vitro que utilizan diferenciar madre embrionarias (ES) de células. La apoptosis es una forma bien estudiado de PCD, que implica tanto intrínseca y extrínseca de señalización para activar la cascada de enzimas caspasas. Cambios característicos celulares incluyen formación de ampollas en la membrana, contracción nuclear y la fragmentación del ADN. Otras formas de PCD no implican la activación de caspasas y puede ser el resultado final de la autofagia prolongado. Independientemente de la vía de PCD, las células que mueren necesitan ser removidos. En los adultos, las células inmunes performe esta función, mientras que en los embriones, donde el sistema inmune todavía no se ha desarrollado, la eliminación se produce por un mecanismo alternativo. Este mecanismo consiste en células vecinas (llamados &quot;no profesionales&quot; fagocitos) que asumen un papel fagocítico-reconocen la &quot;cómeme&quot; señal en la superficie de la célula que muere y lo engullen 8-10. Después de inmersión, los escombros se lleva a los lisosomas para degradación. Así, independientemente del mecanismo PCD, un aumento de la actividad lisosomal se puede correlacionar con una mayor muerte celular. Para el estudio de PCD, un ensayo simple de visualizar los lisosomas en los tejidos gruesos y multicapa culturas diferenciadoras pueden ser útiles. LysoTracker colorante es una molécula pequeña altamente soluble que es retenido en ácidos compartimentos subcelulares tales como el lisosoma 11-13. El colorante es absorbido por difusión y por medio de la circulación. Dado que la penetración no es un obstáculo, la visualización de la CPD en los tejidos gruesos y las culturas de varias capas es posible 12,13 </sup&gt;. En contraste, los TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferasa dUTP nick fin de etiquetado) análisis 14, se limita a muestras pequeñas, secciones histológicas, y cultivos en monocapa debido a que el procedimiento requiere la entrada / permeabilidad de una transferasa terminal. En contraste con azul de anilina, que se difunde y se disuelve por disolventes, LysoTracker Red DND-99 se puede fijar, brillante y estable. La tinción puede ser visualizada con microscopía confocal fluorescente estándar o en todo el montaje o sección utilizando medio de montaje acuoso o de disolvente 12,13. Aquí se describen los protocolos que utilizan este medio de contraste para ver la CPD en normal y sonic hedgehog embriones de ratones nulos. Además, se demuestra el análisis de PCD en la diferenciación de cultivos de células ES y presentar un método de cuantificación simple. En resumen, la tinción LysoTracker puede ser un gran complemento a otros métodos de detección de PCD.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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23.0K vistas.  University of Southern California. Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

Video: Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Investigación

Biología

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas